Prednosti i nedostaci višefotonske laserske skenirajuće mikroskopije
Višefotonska laserska skenirajuća mikroskopija je eksperimentalna metoda koja se temelji na tehnologiji laserske skenirajuće mikroskopije, koja pruža točnije mogućnosti optičkog rezanja u trodimenzionalnom promatranju. Metoda pobuđivanja višefotonske fluorescencije koristi crveno svjetlo dugih valnih duljina ili blisko infracrveno svjetlo za prikupljanje fluorescentnih slika visoke rezolucije uzoraka, što minimalno oštećuje žive uzorke, tako da je prikladno za snimanje živih stanica, posebno za debela živa tkiva kao što su npr. rezovi mozga, embriji, slikovne studije cijelih organa ili čak cijelih organizama.
Prednosti su sljedeće:
1. Pobuđeno crvenim svjetlom ili infracrvenim svjetlom, raspršenje svjetlosti je malo (raspršenje malih čestica obrnuto je proporcionalno četvrtoj potenciji valne duljine).
2. Nema potrebe za rupicama i može se prikupiti više raspršenih fotona iz odjeljka za snimanje.
3. Rupica ne može razlikovati raspršene fotone emitirane iz područja izvan fokusa ili područja fokusa, a omjer signala i šuma višefotonske slike u dubokim slojevima je dobar.
4. Uzorak lako apsorbira i prigušuje ultraljubičasto ili vidljivo svjetlo koje se koristi za pobuđivanje jednim fotonom prije nego što zraka dosegne žarišnu ravninu, a nije lako pobuditi duboke slojeve.
5. Što se tiče promatranja biološkim mikroskopom, prvo što treba uzeti u obzir je ne oštetiti aktivno stanje samog organizma, te održati cirkulaciju vode, koncentraciju iona, kisika i hranjivih tvari. U slučaju promatranja svjetla, i toplinska i fotonska energija moraju ostati unutar količine zračenja i svjetlosne energije koja neće oštetiti stanice.
6. Višefotonska mikroskopija također ima mnoge prednosti. Kao što su trodimenzionalna rezolucija, duboko prodiranje, učinkovitost raspršenja, pozadinsko svjetlo, omjer signala i šuma, kontrola itd., postoje superiorne karakteristike koje laserski mikroskopi nemaju ili su u prošlosti imali neusporedive.
Višefotonska konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija proširena je na različita područja istraživanja i primjene. Može izvoditi trodimenzionalno nedestruktivno promatranje uzoraka u prirodnom stanju i može poboljšati razlučivost i omjer signala i šuma sustava. Upotrebom materijala za višefotonsku pobudu također može realizirati trodimenzionalnu pohranu podataka o visini i trodimenzionalnu mikroproizvodnju proizvoljnog smjera, što ima veliku vrijednost primjene. Vjeruje se da će s daljnjim razvojem strojeva, materijala i laserske tehnologije vezane za višefotonsku konfokalnu mikroskopiju, biti više Fotonski konfokalni laserski skenirajući mikroskop će dobiti veći razvoj i širu primjenu.
Nedostaci su sljedeći:
1. Samo za fluorescentno snimanje.
2. Ako uzorak uključuje kromofore koji mogu apsorbirati pobudno svjetlo, kao što su pigmenti, uzorak može biti termički oštećen.
3. Razlučivost je malo smanjena. Iako se istovremenim korištenjem konfokalne blende može poboljšati, signal će se izgubiti.
4. Zbog ograničenja skupih ultrabrzih lasera, cijena višefotonskog skenirajućeg mikroskopa je relativno visoka.
