Prednosti poboljšanja laserskih skenirajućih višefotonskih mikroskopa
Višefotonski mikroskop s laserskim skeniranjem značajno je poboljšanje optičke mikroskopije, koje se uglavnom očituje u sposobnosti promatranja dubokih struktura živih stanica, fiksnih stanica i tkiva te dobivanja jasnih i oštrih više{0}}slojnih Z-struktura u ravnini, odnosno optičkih rezova, koji se mogu koristiti za konstruiranje tro-dimenzionalnih čvrstih struktura uzoraka. Konfokalni mikroskop koristi laserski izvor svjetlosti, koji je proširen da ispuni cijelu žarišnu ravninu leće objektiva, a zatim konvergira u vrlo male točke na žarišnoj ravnini uzorka kroz sustav leća objektiva. Prema numeričkom otvoru leće objektiva, promjer svijetle točke osvjetljenja je oko 0,25-0,8 μm, a dubina oko 0,5-1,5 μm. Veličina konfokalne točke određena je dizajnom mikroskopa, valnom duljinom lasera, karakteristikama objektiva, postavkama stanja jedinice za skeniranje i svojstvima uzorka. Raspon osvjetljenja i dubinsko polje mikroskopa su veliki, dok je osvjetljenje konfokalnog mikroskopa fokusirano na žarišnu točku na žarišnoj ravnini. Osnovna prednost konfokalne mikroskopije je u tome što može izvesti fino optičko rezanje na debelim fluorescentnim uzorcima (do 50 μm ili više), debljine od približno 0,5 do 1,5 μm. Niz slika optičkih presjeka može se dobiti pomicanjem uzorka gore-dolje pomoću koračnog motora mikroskopa osi Z-. Prikupljanje slikovnih informacija kontrolira se unutar * * ravnine, bez smetnji od signala emitiranih s drugih položaja na uzorku. Nakon uklanjanja utjecaja pozadinske fluorescencije i povećanja omjera signala i šuma, kontrast i razlučivost konfokalnih slika značajno su poboljšani u usporedbi s tradicionalnim fluorescentnim slikama osvjetljenja polja. U mnogim uzorcima, zamršene strukturne komponente isprepliću se kako bi oblikovale složene sustave, ali kada se može prikupiti dovoljno optičkih presjeka, možemo koristiti softver za njihovu rekonstrukciju u tri dimenzije. Ova eksperimentalna metoda naširoko se koristi u biološkim istraživanjima za razjašnjavanje složenih strukturnih i funkcionalnih odnosa između stanica ili tkiva.
