Procjena različitih metoda mikroskopije visoke rezolucije
Za konvencionalnu svjetlosnu mikroskopiju, difrakcija svjetlosti ograničava razlučivost slike na približno 250 nm. Današnje tehnike super-razlučivosti mogu to poboljšati za više od faktora 10. Ova tehnika se uglavnom postiže kroz tri metode: lokalizacijska mikroskopija jedne molekule, uključujući fotoosjetljivu lokalizacijsku mikroskopiju (PALM) i stohastičku optičku rekonstrukcijsku mikroskopiju (STORM); strukturirana iluminacijska mikroskopija (SIM); i stimulirana emisiona depleciona mikroskopija (STED). Kako odabrati tehnologiju super-razlučivosti ono je o čemu svi brinu. "Nažalost, ne postoje jednostavna načela za odlučivanje koju metodu koristiti", kaže Mathew Stracy, postdoktorand na Sveučilištu Oxford, UK. "Svaki ima svoje prednosti i nedostatke." Znanstvenici naravno također smišljaju kako odabrati pravu metodu za određeni projekt. "U kontekstu bioimaginga, ključni čimbenici koje treba razmotriti uključuju: prostornu i vremensku rezoluciju, osjetljivost na fotooštećenje, kapacitet označavanja, debljinu uzorka i pozadinsku fluorescenciju ili staničnu autolognu fluorescenciju." Kako to radi Razni mikroskopi visoke razlučivosti rade na različite načine. U slučaju PALM i STORM, samo mali dio fluorescentnih markera je pobuđen ili fotoaktiviran u određenom trenutku, što omogućuje njihovu neovisnu lokalizaciju s visokom preciznošću. Prolazak kroz ovaj proces sa svim fluorescentnim naljepnicama rezultira potpunom slikom super rezolucije.
Stefan Hell, jedan od dobitnika Nobelove nagrade za kemiju 2014. i direktor Instituta za biofizičku kemiju Max Planck, rekao je: "Sustav PALM/STORM je relativno jednostavan za postavljanje, ali ga je teško primijeniti, jer fluorescentni grupa mora imati sposobnost fotoaktivacije. Ograničenja. Nedostatak je što trebaju detektirati jednu fluorescentnu molekulu u kontekstu stanice i manje su pouzdani od STED-a." STED koristi laserski puls za pobuđivanje fluorofora i laser u obliku prstena za gašenje fluorofora, ostavljajući samo srednju fluorescenciju nanometarske veličine za super-rezoluciju. Skeniranjem cijelog uzorka dobiva se slika. "Prednost STED-a je u tome što se radi o tehnologiji pritiskanja gumba", objasnio je Hell. "Radi kao standardni konfokalni fluorescentni mikroskop." Također može prikazati žive stanice pomoću fluorofora kao što su zeleni ili žuti fluorescentni proteini i boje dobivene od rodamina. Parametarska usporedba Iako sve tehnike super-rezolucije nadmašuju konvencionalnu svjetlosnu mikroskopiju u smislu rezolucije, one se međusobno razlikuju. SIM otprilike udvostručuje razlučivost na oko 100 nm. PALM i STORM mogu riješiti ciljeve od 15 nm. Prema Hellu, STED pruža prostornu rezoluciju od 30 nm u živim stanicama i 15 nm u fiksnim stanicama. Kada je riječ o specifičnim primjenama, moramo uzeti u obzir i omjer signala i šuma.
U nekim slučajevima niža razlučivost, ali viši SNR može rezultirati boljom slikom od suprotnog (veća razlučivost, ali niži SNR). Brzina dobivanja slike je također vrlo važna, posebno za žive stanice. "Sve tehnike super-rezolucije su sporije od konvencionalnih tehnika fluorescentnog snimanja", rekao je Stracy. "PALM/STORM je najsporiji, trebaju mu deseci tisuća okvira za dobivanje jedne slike, SIM treba desetke okvira, a STED je tehnologija skeniranja, tako da brzina akvizicije ovisi o veličini vidnog polja." Uz žive stanice ili fiksne slikovne stanice, neki znanstvenici također žele razumjeti kako se objekti kreću. Stracyja zanima razumijevanje dinamike bioloških sustava u živim stanicama, a ne samo statične slike. On kombinira PALM s praćenjem pojedinačnih čestica za analizu dinamike u živim stanicama. Na taj način može izravno pratiti molekule markera dok obavljaju svoje funkcije. No, smatra da SIM nije prikladan za proučavanje tih dinamičkih procesa na molekularnoj razini, ali je zbog svoje velike brzine stjecanja posebno prikladan za promatranje dinamike većih struktura, poput cijelih kromosoma.
Najnoviji rezultati Godine 2017. Hellov tim izvijestio je o MINFLUX mikroskopu super rezolucije u časopisu Science. Prema Hellu, ova metoda super-razlučivosti po prvi put postiže prostornu rezoluciju od 1 nm. Osim toga, može pratiti pojedinačne molekule u živim stanicama najmanje 100 puta brže od drugih metoda. I drugi su znanstvenici pohvalno govorili o mikroskopu MINFLUX. "Neprestano se razvijaju nove aplikacije i pristupi, ali izdvajam dva napretka", rekao je Shechtman. Jedan je MINFLUX. "Koristi genijalan pristup za vrlo precizno molekularno pozicioniranje." Što se tiče drugog uzbudljivog razvoja događaja, Shechtman je spomenuo WE Moernera i njegove kolege sa Sveučilišta Stanford. Moerner je također bio dobitnik Nobelove nagrade za kemiju 2014. godine. Jedan od dobitnika. Kako bi se pozabavili ograničenjem razlučivosti slike uzrokovanog anizotropnim raspršenjem pojedinačnih fluorescentnih molekula, znanstvenici su koristili različite polarizacije pobude kako bi odredili orijentaciju i položaj molekula. Osim toga, imaju razvijene delikatne površine zjenica. Ove tehnike poboljšavaju sposobnost lokalizacije struktura. O fluorescentnim naljepnicama U mnogim aplikacijama visoke razlučivosti, naljepnice su stvarno važne. Postoje i neke tvrtke koje nude srodne proizvode.
Na primjer, njemački Miltenyi udružio se s Abberiorom, tvrtkom koju je osnovao Stefan Hell, kako bi pružio prilagođene usluge konjugacije antitijela za mikroskopske boje super rezolucije. Brojne druge tvrtke također nude odgovarajuće markere. "Naši Nano-pojačivači su vrlo mali, samo 1,5 kDa, i vrlo specifični", kaže Christoph Eckert, marketinški službenik u ChromoTeku. Ovi proteini vežu zelene i crvene fluorescentne proteine (GFP i RFP). Izvedeni su iz fragmenata antitijela alpake, poznatih kao VHH ili nanotijela, s izvrsnim svojstvima vezivanja i stabilnom kvalitetom bez varijacija od serije do serije. Ovi su markeri prikladni za različite tehnike super-razlučivosti uključujući SIM, PALM, STORM i STED. Ai-Hui Tang, asistent profesora na Medicinskom fakultetu Sveučilišta u Marylandu, i njegovi kolege koristili su ChromoTekov GFP-Booster i STORM za istraživanje širenja informacija u živčanom sustavu. Pronašli su molekularne nanoklastere, nazvane nanokolone, u presinaptičkim i postsinaptičkim neuronima. Znanstvenici vjeruju da ova struktura pokazuje da središnji živčani sustav koristi jednostavne principe za održavanje i regulaciju sinaptičke učinkovitosti. Različite verzije snimanja super-razlučivosti i sve veći broj metoda vode znanstvenike još dublje u biološke misterije. Probijajući granicu difrakcije vidljive svjetlosti, biolozi čak mogu "pomno pratiti" djelovanje stanica.
