Primjena fluorescentne fluorescentne mikroskopije totalne unutarnje refleksije
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), fluorescentni mikroskop s potpunom unutarnjom refleksijom, kada svjetlost uđe u medij s nižim indeksom loma iz medija s visokim indeksom loma, ako je upadni kut dovoljno velik, sva se svjetlost reflektira bez loma, ali u Sučelje dvaju medija proizvodi evanescentne valove koji mogu pobuditi fluorescenciju unutar 100 nm u blizini sučelja kako bi se ostvarilo promatranje površine objekta. Ekscitacijsko svjetlo može se poslati kroz iluminator konvencionalnog fluorescentnog mikroskopa ili kroz poseban iluminator, a upadni kut lasera može se kontrolirati. Metoda trenutne pobude polja koristi se za sprječavanje ulaska pobudne svjetlosti u detektor. Svjetlo pobude na granici između stakla i vode stvara potpunu unutarnju refleksiju. Zbog eksponencijalne atenuacije pobudnog svjetla, samo će područje uzorka vrlo blizu ukupne refleksijske površine proizvesti fluorescentnu refleksiju, što uvelike smanjuje interferenciju šuma pozadinskog svjetla na cilj promatranja, tako da se ova tehnologija široko koristi u dinamičkom promatranju. tvari na površini stanice.
Shematski dijagram fluorescentne mikroskopije totalne unutarnje refleksije (TIRFM)
①Uzorak ②Raspon evanescentnih valova ③Pokrovno staklo ④Uranjanje u ulje ⑤Meta ⑥Emisiona zraka (signal) ⑦Pobudna zraka
Da bi se postigla potpuna unutarnja refleksija, potreban je veliki upadni kut, na primjer, upadni kut na granici staklo-voda veći je od 61 stupnja. To se može postići prizmom, koja se naziva TIRFM na bazi prizme, ili lećom objektiva s velikim numeričkim otvorom, koja se naziva TIRFM tipa objektiva. Trenutačni komercijalizirani fluorescentni mikroskopi s potpunom unutarnjom refleksijom općenito su tipa objektiva, velike brzine i visoke preciznosti.
Fluorescencijska mikroskopija s potpunom unutarnjom refleksijom naširoko se koristi u nekim biološkim područjima jer može ostvariti promatranje fluorescencije u vrlo tankom rasponu (manje od 100 nm) na površini predmeta. Kao što su sljedeće aplikacije:
Promatranje slika površine stanice: struktura površine stanične membrane, kontakt površine stanice, dinamika površine membrane/lokalizacija proteina.
Promatranje i manipulacija jednom molekulom: miozin, aktin i Cy3-označeni ATP.
Pokretanje površine stanične membrane: kao što je gutanje vezikula, izdisaj vezikula i egzokrina vezikula. the
Promatranje fenomena iskrenja kalcija u staničnoj membrani, praćenje ionskih kanala.
Istraživanje molekularne motorike: rotacijski motori, citoskeletni proteini, polimeri, G proteini, prstenasti proteini, nukleotidni motori.
Osim u području biologije, također ima dobre primjene u području kemije za promatranje kemijskih molekularnih struktura.
