Primjena suvremenog koncepta mikroskopa u promatranju mikroskopskog svijeta
Od davnina do danas, ljudska bića su slijedila više i dalje istine. Od oceanskih putovanja do istraživanja svemira, ljudi su osvajali velike ciljeve jedan za drugim. Međutim, makroskopski svijet koji ljudi vide golim okom nije cijeli svijet i ljudsko oko ga ne može jasno vidjeti. Također privlači nebrojene ljude da istražuju i slijede.
Bez obzira radi li se o makroskopskim ili mikroskopskim stvarima, naša opažanja temelje se na atributima trodimenzionalnog prostora, odnosno XYZ trodimenzionalnog, a u promatranje promjena oblika stvari potrebno je uvesti još jedan mjerni faktor - vrijeme T, pa je najcjelovitiji način promatranja stvari mora biti Simultano snimanje XYZT, odnosno dugotrajno fotografiranje oblika plus vrijeme, također je krajnja funkcija mikroskopa.
Nakon više od 300 godina razvoja, moderni mikroskopi predložili su koncepte kao što su razlučivost, dubinska oštrina i vidno polje, te kontinuirano predlagali rješenja. Mikroskopi su u početku zadovoljavali naše potrebe za promatranjem mikroskopskog svijeta i pomagali nam da bilježimo prostor i vrijeme mikroskopskog svijeta.
Najvažnija stvar u mikroskopskom promatranju svijeta je razlučivost detalja, a pojam razlučivosti nastao je iz toga. Rezolucija se odnosi na minimalnu udaljenost između dviju točaka koje ljudsko oko može razlikovati, a vrijedi samo u XY dimenziji. Prema Rayleighovom kriteriju, Rayleighov kriterij, granica koju normalni ljudi mogu razlikovati su dvije točke od 0.2 mm na udaljenosti od 25 cm. Kada koristimo mikroskop, možemo vidjeti dvije točke na manjoj udaljenosti, što poboljšava rezoluciju našeg promatranja. Sa stalnim produbljivanjem modernih istraživanja, zahtjevi ljudi za rezolucijom su također u stalnom porastu, a znanstvenici također konstantno poboljšavaju rezoluciju mikroskopa. Primjerice, elektronski mikroskopi povećali su rezoluciju na nanometarsku razinu, što omogućuje promatranje virusa. Ultravisoka mikroskopska tehnologija snimanja poboljšava razlučivost mikroskopa s 200 nanometara na desetke nanometara, ostvarujući promatranje živih staničnih organela.
Poboljšanje rezolucije donosi i nove probleme, odnosno smanjenje vidnog polja i dubinske oštrine. Kada se koristi uobičajena metoda središnjeg osvjetljenja (metoda fotopičkog osvjetljenja koja čini da svjetlost ravnomjerno prolazi kroz uzorak), udaljenost rezolucije mikroskopa je d=0.61 λ/NA, raspon valnih duljina vidljive svjetlosti je { {2}}nm, prosječna valna duljina je 550 nm, a valna duljina je fiksna konstanta. Stoga povećanjem NA vrijednosti može se dobiti manja D vrijednost, odnosno udaljenost između dviju točaka koje se mogu razlikovati Manja, što omogućuje ljudima da jasno vide manje objekte.
Vrijednost NA je numerička apertura, koja opisuje veličinu kuta stošca koji prima svjetlost leće, NA=n * sin , to jest umnožak indeksa loma (n) medija između leće i objekt koji se pregledava i sinus polovice kuta otvora (2). n je indeks loma svjetlosti medija između leće objektiva i uzorka. Kada je prostorni medij mikroskopa objekt zrak, indeks loma n=1. Korištenje medija s višim indeksom loma od zraka može značajno povećati NA vrijednost. Medij za uranjanje u vodu je destilirana voda, a indeks loma Omjer je 1,33; medij uljnog imerzijskog objektiva je cedrovo ulje ili druga prozirna ulja, a njegov indeks loma je općenito oko 1,52, što je blizu indeksa loma leće i dijapozitiva. Stoga je vrijednost NA uljne leće veća od one zračne leće.
Kut otvora blende, također poznat kao "kut otvora zrcala", je kut koji čine točka objekta na optičkoj osi leće i efektivni promjer prednje leće leće objektiva. Povećanje kuta otvora zrcala može povećati vrijednost sinusa, a njegova stvarna gornja granica je oko 72 stupnja (vrijednost sinusa je 0.95), pomnoženo s indeksom loma cedrovog ulja 1,52, može se dobiti da maksimalna NA vrijednost je oko 1,45, a ako se zamijeni u formuli za izračun rezolucije, može se dobiti da je granična rezolucija XY ravnine konvencionalnog mikroskopa oko 0.2um.
Vrijednost NA također izravno utječe na svjetlinu vidnog polja mikroskopa (B). Iz formule B∝NA2/M2 možemo zaključiti da svjetlina raste s povećanjem numeričke blende (NA) ili smanjenjem povećanja objektiva (M).
Teoretski, trebali bismo težiti najvišoj mogućoj vrijednosti NA kako bismo dobili bolju rezoluciju ravnine XY i svjetlinu vidnog polja. Ipak, sve ima dvije strane. Poboljšanje rezolucije u ravnini XY smanjit će dubinsku oštrinu Z-osi i vidno polje promatranja.
Mikroskopi općenito gledaju okomito prema dolje. Kada se konveksni položaj i konkavni položaj na površini objekta promatrane unutar promjera vidnog polja mogu jasno vidjeti, tada je visinska razlika između konveksne točke i konkavne točke dubina polja. Pa, za mikroskope, što je veća dubina polja, to bolje. Što je veća dubina polja, to se bolje i jasnije trodimenzionalne slike mogu dobiti pri promatranju površine neravnih objekata. Velika dubina polja pomaže nam promatrati mikroskopski svijet u okomitom smjeru. To jest, informacije o Z-osi u trodimenzionalnom obliku XYZ.
Dubina polja je dubina prednjeg i stražnjeg prostora koja odgovara jasnoj slici na ravnini slike: dtot=(λ*n)/NA plus n/(M∗NA) * e, dtot: dubina polja , NA: numerička apertura, M: ukupno povećanje, λ: valna duljina svjetlosti, (obično λ=0.55um), n: indeks loma medija između uzorka i leće objektiva (zrak: n{{3 }}, ulje: n=1.52) Prema ovoj formuli, možemo znati da je dubina polja Z osi obrnuto proporcionalna vrijednosti NA ravnine XY.
Osim dubine polja, na vidno polje utječe i NA vrijednost. Prostorni raspon koji se može vidjeti kada instrument nepomično gleda u točku je vidno polje. Njegov izračun izravno je povezan s povećanjem leće objektiva. Stvarni promjer vidnog polja koji se vidi promatranjem jednak je promjeru vidnog polja podijeljenog s povećanjem leće objektiva, okular će pokazivati odgovarajuće vidno polje, kao što je 10/18, tj. povećanje je 10 puta, a promjer vidnog polja 18mm. Stoga, kada se odredi okular, što je veće povećanje, to je manje promatrano vidno polje.
Rezolucija ravnine XY je analiza lokalnih detalja, a vidno polje određuje naš raspon promatranja uzorka. Što je veće vidno polje, to bolje, ali ograničeno trenutnom tehnologijom, moramo koristiti objektive velike snage da bismo dobili dobre NA vrijednosti, stoga, vidno polje i NA vrijednosti imaju neizravnu negativnu korelaciju.
