Usporedba konfokalnog i običnog optičkog mikroskopa
Opći optički mikroskop
Opći biološki mikroskop sastoji se od tri dijela, naime: ① sustav osvjetljenja, uključujući izvor svjetlosti i kondenzator; ② Sustav optičkog pojačanja, koji se sastoji od objektiva i okulara, glavno je tijelo mikroskopa. Kako bi se uklonile sferne i kromatske aberacije, okular i leća objektiva sastavljeni su od složenih skupina leća; (3) mehanički uređaj, koji se koristi za pričvršćivanje materijala i prikladno promatranje.
Hoće li mikroskopska slika biti jasna ili ne ovisi ne samo o povećanju, već i o razlučivosti mikroskopa. Rezolucija se odnosi na sposobnost mikroskopa (ili mjesta gdje su ljudske oči udaljene 25 cm od cilja) da razlikuje mali interval zui objekta. Razlučivost ovisi o valnoj duljini svjetlosti, omjeru otvora blende i indeksu loma medija koji se izražava formulom:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎgrijeh /2
Gdje je: n= indeks loma medija;=zrcalni kut (kut otvaranja uzorka prema otvoru leće) i NA= numerička apertura. Kut zrcala uvijek je manji od 180? Stoga, zui vrijednost sina/2 mora biti manja od 1.
Indeks loma stakla koje se koristi za izradu optičkih leća je 1,65~1,78, a indeks loma upotrijebljenog medija je što bliži indeksu loma stakla, to bolje. Za leću suhog objektiva medij je zrak, a omjer otvora blende općenito je 0.05 ~ 0,95; Uljna leća koristi mirisni asfalt kao medij, a brzina otvaranja leće može biti blizu 1,5.
Valna duljina obične svjetlosti je 400~700 nm, tako da razlučivost mikroskopa nije manja od 0,2 μm, a razlučivost ljudskog oka je 0,2 mm, tako da je veliko povećanje zui dizajnirao opći mikroskop je obično 1000X x.
Zašto vam je potreban konfokalni mikroskop?
1. Optički mikroskop je usavršen trudom i usavršavanjem naših velikih prethodnika. U stvari, obični mikroskopi mogu nam jednostavno i brzo pružiti prekrasne mikroskopske slike. Međutim, dogodio se događaj koji je donio revolucionarnu inovaciju u ovaj gotovo savršen svijet mikroskopa, a to je izum "laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa". Ovaj novi mikroskop karakterizira usvajanje optičkog sustava koji samo izdvaja informacije o slici u ravnini gdje je fokus koncentriran i vraća dobivene informacije u memoriju slike dok mijenja fokus, tako da se dobiva živa slika s potpunim trodimenzionalnim informacijama može se dobiti. Ovom metodom jednostavno se mogu dobiti podaci o obliku površine koji se ne mogu potvrditi običnim mikroskopima. Osim toga, za obične optičke mikroskope, "poboljšanje rezolucije" i "produbljivanje dubine fokusa" su kontradiktorni uvjeti, posebno pri velikom povećanju, ali za konfokalne mikroskope, ovaj problem je riješen.
2. Prednosti konfokalnog optičkog sustava
Konfokalni optički sustav osvjetljava točku uzorka, a reflektirano svjetlo također primaju točkasti receptori. Kada se uzorak postavi u fokusni položaj, gotovo sva reflektirana svjetlost može doprijeti do fotoreceptora, ali kada uzorak odstupi od fokusa, reflektirana svjetlost ne može doprijeti do fotoreceptora. Odnosno, u konfokalnom optičkom sustavu izlazi samo slika koja se poklapa s fokusom, a fakula i beskorisna raspršena svjetlost bit će zaštićeni.
3. Zašto koristiti laser?
U konfokalnom optičkom sustavu uzorak se osvjetljava, a reflektirano svjetlo također prima točkasti fotoreceptor. Stoga postaje neophodan točkasti izvor svjetlosti. Laser spada u vrlo točkaste izvore svjetlosti. U većini slučajeva, izvor svjetlosti konfokalnog mikroskopa usvaja laserski izvor svjetlosti. Osim toga, karakteristike lasera, kao što su monokromatičnost, usmjerenost i odličan oblik snopa, također su važni razlozi njegove široke upotrebe.
4. Promatranje u stvarnom vremenu temeljeno na brzom skeniranju postaje moguće.
U laserskom skeniranju koristi se akustični optički deflektor (AO primarni element) u horizontalnom smjeru, a Servo Galvano-zrcalo u vertikalnom smjeru. Budući da nema mehaničkih vibracija u jedinici za akustičnu optičku otklon, ona može skenirati velikom brzinom, a moguće je promatrati u stvarnom vremenu na zaslonu za praćenje. Velika brzina ove kamere vrlo je važan projekt koji izravno utječe na brzinu fokusiranja i dohvaćanja položaja.
5. Odnos između položaja fokusa i svjetline
U konfokalnom optičkom sustavu, kada je uzorak pravilno postavljen u fokusnu poziciju, svjetlina je velika, a prije i poslije njega će njegova svjetlina naglo pasti (puna linija na slici 4). Ova osjetljiva selektivnost žarišne ravnine također je princip mjerenja smjera visine konfokalnog mikroskopa i proširenja žarišne dubine. Nasuprot tome, obični optički mikroskop nema očitu promjenu svjetline prije i nakon položaja fokusa (točkasta linija na slici 4).
6. Visoki kontrast i visoka rezolucija
U općenitom optičkom mikroskopu, reflektirana svjetlost koja odstupa od fokusa će interferirati i preklapati će se s dijelom slike fokusa, smanjujući tako kontrast slike. Nasuprot tome, u konfokalnom optičkom sustavu, raspršena svjetlost izvan fokusa i raspršena svjetlost unutar leće objektiva su gotovo potpuno uklonjene, tako da se može dobiti slika s vrlo visokim kontrastom. Osim toga, budući da svjetlost dvaput prolazi kroz leću objektiva, prvo se izoštrava točkasta slika, a poboljšava se i razlučivost mikroskopa.
7. Funkcija optičke lokalizacije
U konfokalnom optičkom sustavu, reflektirana svjetlost dijela koji nije žarišna točka zaštićena je mikroporama. Stoga se pri promatranju trodimenzionalnog uzorka stvara slika poput one koja nastaje nakon rezanja uzorka s fokusom (Slika 5). Taj se efekt naziva optička lokalizacija, što spada u jednu od posebnosti konfokalnog optičkog sustava.
8. Funkcija pomicanja fokusa
Takozvana reflektirana svjetlost izvan fokusa zaštićena je mikroporama. S druge strane, može se smatrati da se sve točke na slici koju formira konfokalni optički sustav poklapaju s fokusom. Stoga, ako se trodimenzionalni uzorak pomiče duž Z-osi (optičke osi), slika će se akumulirati i pohraniti u memoriju, a zui će na kraju dobiti sliku formiranu koincidencijom cijelog uzorka i fokusa . Na taj se način funkcija beskonačne dubine fokusa naziva funkcijom mobilne memorije.
9. Funkcija mjerenja oblika površine
U funkciji pomicanja fokusa, oblik površine uzorka može se mjeriti na beskontaktni način dodavanjem petlje za bilježenje visine. Na temelju ove funkcije moguće je zabilježiti koordinate Z-osi koje oblikuje velika vrijednost svjetline zui u svakom pikselu, a na temelju tih informacija mogu se dobiti informacije vezane uz oblik površine uzorka.
10. Visokoprecizna funkcija mjerenja mikro veličine
Jedinica za primanje svjetla koristi jednodimenzionalni CCD senzor slike, tako da na nju ne može utjecati nagib uređaja za skeniranje, tako da se može izvršiti visoko precizno mjerenje. Osim toga, budući da je istovremeno usvojena funkcija memorije pomicanja fokusa s podesivom dubinom fokusa, pogreška mjerenja uzrokovana pomakom fokusa može se eliminirati.
11. Analiza trodimenzionalne slike
Pomoću funkcije mjerenja oblika površine može se lako napraviti trodimenzionalna slika površine uzorka. I ne samo to, već se mogu provesti i mnoge vrste analiza, kao što su: mjerenje hrapavosti površine, površine, volumena, površine, kružnosti, radijusa, duljine zui, opsega, težišta, tomografske slike, FFT transformacije, linije mjerenje širine i tako dalje.
Laserski konfokalni skenirajući mikroskop može se koristiti ne samo za promatranje stanične morfologije, već i za kvantitativnu analizu biokemijskih komponenti u stanicama, statistiku optičke gustoće i mjerenje stanične morfologije.
