Trend razvoja konfokalne mikroskopije
Kako bi se dobili bolji rezultati promatranja na tehničkoj razini, konfokalna mikroskopija usmjerena je na poboljšanje tehničke razine s aspekta poboljšanja rezolucije, smanjenja fototoksičnosti, povećanja brzine skeniranja, promatranja debelih uzoraka i promatranja in vivo. Trenutno je Z učinkovit. Ono što promiče Zda za tehnologiju konfokalne mikroskopije je mikroskopija ultra visoke rezolucije, koja probija optičku granicu i omogućuje istraživačima dobivanje finijih staničnih struktura, što je pogodno za dublje razumijevanje životnih aktivnosti istraživača. Sljedeći istraživački fokus tehnologije konfokalne mikroskopije trebao bi se usredotočiti na sljedeće točke:
1. Veća brzina skeniranja
Trenutačno je brzina konfokalnog skeniranja ograničena mehaničkom strukturom opreme za skeniranje, a razlučivost se može žrtvovati samo kako bi se postigla veća brzina skeniranja. Mnogi biološki procesi su toliko brzi da se ne mogu otkriti.
2. Savršenija tehnologija ultra visoke razlučivosti
Trenutačno tehnologije ultravisoke razlučivosti uključuju STORM, PALM, STED i SSIM, s razlučivostima u rasponu od 20 do 200 nm, ali svaka tehnologija ima određene nedostatke, poput obrade uzorka, smjera Z-osi, fototoksičnosti itd. To je nije ni približno savršen i često je teško postići graničnu rezoluciju u stvarnom promatranju.
3. Jača kompatibilnost
Tehnologija konfokalne mikroskopije uključuje različite metode pobuđivanja, kao što je gore spomenuto promatranje višefotona i svjetlosnog sloja, a koherentno anti-Stokesovo Ramanovo raspršenje može teoretski dijeliti skup laserskih sustava. Mikroskopija super rezolucije može se upariti s tehnologijom bijelog lasera. Međutim, zbog problema s patentima raznih tvrtki, još uvijek ima prostora za poboljšanje u pogledu potpunosti i kompatibilnosti, a trenutna oprema ne može u potpunosti iskoristiti tehničke prednosti aplikacije.
Principi konfokalne mikroskopije
Konfokalni mikroskop sastoji se od četiri dijela: optičkog sustava mikroskopa, izvora laserskog svjetla, skenera te sustava za detekciju i obradu. Kao izvor svjetlosti koristi laser s dobrom koherencijom. Usvaja princip konjugiranog fokusiranja i uređaj na temelju tradicionalnog optičkog mikroskopa i koristi računalni skup promatranja, analize i izlaznog sustava za obradu slike.
Zraka laserskog skeniranja prolazi kroz rupicu na rešetki i formira točkasti izvor svjetlosti, koji se reflektira na leću objektiva kroz razdjelnik zrake, fokusira na uzorak i skenira. Nakon što je uzorak pobuđen, emitirana fluorescencija vraća se u spektroskop i skuplja je u detekcionu rupicu, a zatim je fotomultiplikatorska cijev pretvara u električni signal i prenosi na računalo za prikaz jasne slike u žarišnoj ravnini. Ekscitacijsko svjetlo se fokusira na uzorak kroz rupicu na rešetki, a fluorescencija se fokusira na rupicu kroz leću objektiva. Ovaj proces formira dva fokusa, pa se naziva konfokalni mikroskop.
Obični biološki uzorci imaju složenu strukturu i određenu debljinu. Kada se promatra običnim fluorescentnim mikroskopom, fluorescencija koju emitira uzorak se preklapa jedna s drugom, a rezolucija slike je znatno smanjena.
Konfokalno oslikavanje konfokalnog mikroskopa može učinkovito potisnuti zalutalo svjetlo i svjetlo koje nije za mjerenje izvan žarišne ravnine da uđe u detektor, realizirati sliku jedne žarišne ravnine i uvelike poboljšati razlučivost. Kada se postolje jednoliko pomiče u vodoravnom smjeru, može formirati jasnu jednoslojnu sliku, au okomitom smjeru može ostvariti sloj po sloj skeniranje uzorka na različitim dubinama i dobiti trodimenzionalnu strukturu uzorka nakon trodimenzionalne rekonstrukcije, što je tzv. "optički CT". Uzorak se označi fluorescentnom sondom i zatim promatra konfokalnim mikroskopom. Ne samo da se mogu promatrati različite fiksne stanice i strukture tkiva, već se morfologija, struktura i ioni živih stanica mogu kvalitativno i kvantitativno promatrati i redovito mjeriti.
