Razlika između fluorescentnog mikroskopa i normalnog mikroskopa
Nedavno sam pokušao napraviti neke smrznute dijelove miševa. Zatim ću upotrijebiti fluorescentni mikroskop da vidim je li virus koji sam ubrizgao u područje mozga koje želim. Potrebno je ukratko naučiti neke osnovne principe fluorescentne mikroskopije, a ja ću ih ovdje podijeliti.
Fluorescentni mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetla za osvjetljavanje predmeta koji se pregledava, uzrokujući da objekt emitira svjetlost, a zatim promatraju predmet pod mikroskopom. Uglavnom se koristi za imunofluorescentne stanice. Uglavnom se sastoji od izvora svjetlosti, sustava filtarskih ploča i optičkog sustava. Fluorescentna slika uzorka promatra se kroz povećanje okulara i objektiva. Pogledajmo razliku između fluorescentnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa.
1. Pogledajte način osvjetljenja
Metoda osvjetljavanja fluorescentnog mikroskopa općenito je epi-iluminacija, što znači da se izvor svjetlosti postavlja na ispitni uzorak kroz leću objektiva.
2. Pogledajte rezoluciju
Fluorescentni mikroskopi kao izvor svjetlosti koriste ultraljubičasto svjetlo koje ima kraću valnu duljinu, ali veću rezoluciju od običnih optičkih mikroskopa.
3. Razlike u filterima
Fluorescentni mikroskopi koriste dva posebna filtera, jedan se koristi ispred izvora svjetlosti za filtriranje vidljive svjetlosti, a drugi se koristi između leće objektiva i okulara za filtriranje ultraljubičastih zraka, koje mogu zaštititi ljudske oči.
Fluorescentni mikroskop također je vrsta optičkog mikroskopa. Glavni razlog je što je valna duljina koju pobuđuje fluorescentni mikroskop kratka, pa to dovodi do razlike u strukturi i upotrebi između fluorescentnog mikroskopa i običnog mikroskopa. Većina fluorescentnih mikroskopa ima dobru funkciju hvatanja slabog svjetla. , tako da je njegova sposobnost snimanja također dobra pod izrazito slabom fluorescencijom. Zajedno sa stalnim poboljšanjem fluorescentnih mikroskopa posljednjih godina, buka je također znatno smanjena. Stoga se sve više koriste fluorescentni mikroskopi.
Poznavanje dvofotonske fluorescentne mikroskopije
Osnovni princip dvofotonske ekscitacije je: pod uvjetima visoke gustoće fotona, fluorescentne molekule mogu apsorbirati dva dugovalna fotona u isto vrijeme, te nakon kratkog takozvanog pobuđenog stanja emitirati foton kraće valne duljine . ;Učinak je isti kao korištenje fotona valne duljine upola manje od duge valne duljine za pobuđivanje fluorescentnih molekula. Dvofotonska ekscitacija zahtijeva visoku gustoću fotona. Kako ne bi oštetili stanice, dvofotonski mikroskopi koriste visokoenergetske pulsne lasere s zaključanim modom. Ovaj laser emitira lasersko svjetlo visoke vršne energije i niske prosječne energije, sa širinom impulsa od samo 100 femtosekundi i frekvencijom od 80 do 100 MHz. Kada se koristi leća objektiva s velikim numeričkim otvorom blende za fokusiranje fotona pulsirajućeg lasera, gustoća fotona u fokusu leće objektiva je najveća. Dvofotonska ekscitacija javlja se samo u fokusu leće objektiva, tako da dvofotonski mikroskop ne zahtijeva konfokalnu rupicu, što poboljšava učinkovitost detekcije fluorescencije.
U općem fenomenu fluorescencije, zbog niske gustoće fotona pobudne svjetlosti, fluorescentna molekula može apsorbirati samo jedan foton u isto vrijeme i zatim emitirati jedan fluorescentni foton kroz prijelaz zračenja. Ovo je jednofotonska fluorescencija. Za proces pobuđivanja fluorescencije koji koristi laser kao izvor svjetlosti, može doći do fenomena dvofotonske ili čak višefotonske fluorescencije. U ovom slučaju, intenzitet korištenog pobudnog izvora svjetlosti je visok, a gustoća fotona udovoljava zahtjevu da fluorescentne molekule apsorbiraju dva fotona u isto vrijeme. U procesu korištenja običnih lasera kao ekscitacijskih izvora svjetlosti, gustoća fotona još uvijek nije dovoljna za stvaranje dvofotonske apsorpcije. Obično se koriste femtosekundni pulsni laseri čija trenutna snaga može doseći razinu megavata. Stoga je valna duljina dvofotonske fluorescencije kraća od valne duljine pobudne svjetlosti, što je ekvivalentno učinku polupobudne pobude valne duljine.
