Razlika između fluorescentnog mikroskopa i normalnog mikroskopa
1. Pogledajte način osvjetljenja
Metoda osvjetljavanja fluorescentnog mikroskopa općenito je epi-tip, što znači da se izvor svjetlosti postavlja na ispitni uzorak kroz leću objektiva.
2. Pogledajte rezoluciju
Fluorescentni mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti, s relativno kratkom valnom duljinom, ali je rezolucija veća od one kod običnih optičkih mikroskopa.
3, razlika u filteru
Fluorescentni mikroskop koristi dva posebna filtera, koji se koriste ispred izvora svjetlosti za filtriranje vidljive svjetlosti, a koriste se između leće objektiva i okulara za filtriranje ultraljubičastog svjetla, koje može zaštititi ljudske oči.
Fluorescencijski mikroskop također je vrsta optičkog mikroskopa, uglavnom zato što je valna duljina koju pobuđuje fluorescentni mikroskop kratka, pa to dovodi do razlike u strukturi i upotrebi fluorescentnog mikroskopa i običnog mikroskopa. Većina fluorescentnih mikroskopa ima dobru funkciju hvatanja slabog svjetla. , tako da je pod iznimno slabom fluorescencijom njegova sposobnost snimanja također dobra. Zajedno sa stalnim poboljšanjem fluorescentne mikroskopije posljednjih godina, buka je također znatno smanjena. Stoga se sve više koriste fluorescentni mikroskopi.
Poznavanje dvofotonske fluorescentne mikroskopije
Osnovni princip dvofotonske ekscitacije je: u slučaju velike gustoće fotona, fluorescentne molekule mogu apsorbirati dva dugovalna fotona u isto vrijeme, te nakon vrlo kratkog takozvanog pobuđenog stanja emitirati foton kratke valne duljine. ; učinak je isti kao korištenje fotona valne duljine upola manje od duge valne duljine za pobuđivanje fluorescentne molekule. Dvofotonska ekscitacija zahtijeva visoku gustoću fotona, a kako se ne bi oštetile stanice, dvofotonska mikroskopija koristi visokoenergetske impulsne lasere s zaključanim modom. Ovaj laser emitira lasersko svjetlo visoke vršne energije i niske prosječne energije, sa širinom impulsa od samo 100 femtosekundi i frekvencijom od 80 do 100 MHz. Kada se leća objektiva s visokom numeričkom aperturom koristi za fokusiranje fotona pulsirajućeg lasera, gustoća fotona u žarišnoj točki objektiva je najveća, a dvofotonska ekscitacija javlja se samo u žarišnoj točki objektiva, tako da dvofotonski mikroskop ne treba konfokalnu rupicu, što poboljšava učinkovitost detekcije fluorescencije.
U općem fenomenu fluorescencije, zbog niske gustoće fotona pobudne svjetlosti, fluorescentna molekula može apsorbirati samo jedan foton u isto vrijeme, a zatim emitirati fluorescentni foton kroz prijelaz zračenja, što se naziva jednofotonska fluorescencija. Za proces pobuđivanja fluorescencije s laserom kao izvorom svjetlosti, može doći do fenomena dvofotonske ili čak višefotonske fluorescencije. U ovom trenutku, intenzitet korištenog pobudnog izvora svjetlosti je visok, a gustoća fotona zadovoljava zahtjev da fluorescentna molekula apsorbira dva fotona u isto vrijeme. U procesu korištenja općeg lasera kao izvora pobudne svjetlosti, gustoća fotona još uvijek nije dovoljna da proizvede dvofotonsku apsorpciju. Obično se koristi femtosekundni pulsni laser, čija trenutna snaga može doseći reda veličine megavata. Stoga je valna duljina dvofotonske fluorescencije kraća od valne duljine pobudne svjetlosti, što je ekvivalentno učinku polupobudne pobude valne duljine.
Dvofotonska fluorescentna mikroskopija ima mnoge prednosti:
1) Na svjetlo dugih valnih duljina manje utječe raspršenje nego na svjetlo kratkih valnih duljina i može lako prodrijeti kroz uzorak;
2) Fluorescentne molekule izvan žarišne ravnine nisu pobuđene, tako da više pobudnog svjetla može doprijeti do žarišne ravnine, tako da pobudno svjetlo može prodrijeti dublje u uzorke;
3) Svjetlo duge valne duljine blisko infracrveno je manje toksično za stanice od svjetlosti kratke valne duljine;
4) Pri promatranju uzoraka s dvofotonskom mikroskopijom, fotoizbjeljivanje i fototoksičnost prisutni su samo u žarišnoj ravnini. Stoga je dvofotonska mikroskopija prikladnija za promatranje debelih uzoraka nego jednofotonska mikroskopija, za promatranje živih stanica ili za izvođenje eksperimenata fotoizbjeljivanja s fiksnom točkom.
Poznavanje konfokalne fluorescentne mikroskopije
Osnovno načelo konfokalne fluorescentne mikroskopije: korištenjem točkastog izvora svjetlosti za osvjetljavanje uzorka, mala svjetlosna točka s dobro definiranim obrisom formira se na žarišnoj ravnini. sastavljen od razdjelnika snopa. Razdjelnik snopa šalje fluorescenciju izravno u detektor. Ispred izvora svjetlosti i detektora nalazi se rupica, koja se naziva rupica za osvjetljavanje i rupica za otkrivanje. Geometrijske dimenzije ove dvije su iste, oko 100-200 nm; u odnosu na svjetlosnu točku na žarišnoj ravnini, dvije su konjugirane, to jest, svjetlosna točka prolazi kroz niz leća i na kraju se može fokusirati na rupicu za osvjetljavanje i rupicu za detekciju u isto vrijeme. Na taj način, svjetlost iz žarišne ravnine može se koncentrirati unutar raspona otvora za otkrivanje, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod žarišne ravnine blokirana iz otvora za otkrivanje i ne može se prikazati. Uzorak se laserom skenira točku po točku, a fotomultiplikatorska cijev nakon detekcije rupice također dobiva konfokalnu sliku odgovarajućeg svjetla točku po točku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi u računalo, te na kraju agregira na zaslon u jasnu konfokalnu sliku cijele žarišne ravnine. .
Svaka slika žarišne ravnine zapravo je optički presjek uzorka, a taj optički presjek uvijek ima određenu debljinu, poznatu i kao optički presjek. Budući da je intenzitet svjetla u žarišnoj točki puno veći od intenziteta u nežarišnoj točki, a svjetlost nežarišne ravnine filtrira se rupom, dubina polja konfokalnog sustava je približno nula, a skeniranje duž Z-os može realizirati optičku tomografiju, formirajući dvodimenzionalni optički presjek na fokusiranoj točki uzorka. Kombinacijom skeniranja XY ravnine (žarišne ravnine) sa skeniranjem Z-osi (optičke osi), skupljanjem dvodimenzionalnih slika uzastopnih slojeva i obradom posebnim računalnim softverom, može se dobiti trodimenzionalna slika uzorka.
To jest, rupica za otkrivanje i rupica za izvor svjetlosti uvijek su fokusirane na istu točku, tako da fluorescencija pobuđena izvan ravnine fokusiranja ne može ući u rupicu za detekciju.
Jednostavan izraz principa rada konfokalnog lasera je da koristi laser kao izvor svjetlosti, a na temelju tradicionalnog snimanja fluorescentnim mikroskopom, laserski uređaj za skeniranje i konjugirani uređaj za fokusiranje su priključeni, a digitalno prikupljanje slike i obrada sustavom upravlja računalo.
