Razlike i karakteristike između fluorescentnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa
Fluorescentni mikroskop razlikuje se od običnog optičkog mikroskopa. Ne promatra uzorak kroz osvjetljenje običnog izvora svjetlosti. Umjesto toga, koristi svjetlost određene valne duljine (obično ultraljubičasto svjetlo, plavo-ljubičasto svjetlo) za pobuđivanje fluorescentnog materijala u uzorku pod mikroskopom, uzrokujući njegovo emitiranje fluorescencije. Stoga izvor svjetlosti fluorescentnog mikroskopa ne služi kao izravno osvjetljenje, već kao izvor energije koji pobuđuje unutarnji fluorescentni materijal uzorka. Razlog zašto možemo promatrati uzorak nije zbog osvjetljenja izvora svjetlosti, već fenomena fluorescencije uzrokovanog fluorescentnim materijalom u uzorku koji apsorbira pobuđenu svjetlosnu energiju. Može se vidjeti da je glavna karakteristika fluorescentnog mikroskopa da njegov izvor svjetlosti može dati veliku količinu pobudnog svjetla u određenom rasponu valnih duljina, tako da fluorescentne tvari u uzorku koji se ispituje mogu dobiti potreban intenzitet pobudnog svjetla. Istovremeno, fluorescentni mikroskopi moraju imati odgovarajuće sustave filtera. Fluorescentna mikroskopija bitan je alat za naprednu fluorescentnu histokemiju. Sastoji se od izvora svjetlosti ultravisokog tlaka, sustava filtara (uključujući filtarske ploče za pobudu i potiskivanje), optičkog sustava i sustava za fotografije. Koristi svjetlost određene valne duljine da potakne uzorak da emitira fluorescenciju.
1. Načini pobuđivanja fluorescencije: Prema rasponu valnih duljina svjetlosti, dijeli se na dvije vrste: UV pobudna metoda (pomoću ultraljubičastog osvjetljenja) i BV pobudna metoda (pomoću plavo-ljubičastog svjetla). Metoda UV ekscitacije za ekscitaciju koristi skoro ultraljubičasto svjetlo kraće od 400 nm. U ovoj metodi nema vidljivog pobudnog svjetla, tako da opažena fluorescencija pokazuje svojstvenu fluorescenciju boje, što olakšava razlikovanje specifične fluorescencije na uzorku od autofluorescencije pozadinskog tkiva.
2. BV metoda ekscitacije: ekscitacija od ultraljubičastog do plavog svjetla sa središtem na 404 nm i 434 nm. Ova metoda koristi plavo svjetlo za osvjetljavanje uzorka, tako da filtar za isključivanje fluorescencijskog sustava za promatranje mora koristiti filtar koji može potpuno blokirati plavo svjetlo i u potpunosti propustiti potrebnu zelenu i žutu fluorescenciju. Fluorescentne boje koje se koriste u metodama fluorescentnih antitijela. Maksimalna valna duljina apsorpcije pobudnog svjetla i maksimalna valna duljina emisije fluorescencije relativno su bliske, tako da filtar koji se koristi u BV metodi pobude mora koristiti filter s oštrim prekidom. Ova metoda može koristiti plavo svjetlo kao pobudno svjetlo, tako da je učinkovitost apsorpcije fluorescentnih pigmenata veća i mogu se dobiti svjetlije slike. Nedostatak je što se fluorescencija ispod 500 nm ne može vidjeti, dok fluorescencija iznad 500 nm čini da cijela slika izgleda žuto. U metodi fluorescentnih protutijela, specifičnost fluorescentne boje uglavnom se procjenjuje prema njezinoj jedinstvenoj boji. Stoga, kada se raspravlja o suptilnoj specifičnosti, gore navedeni nedostaci metode ekscitacije BV često imaju veliki utjecaj.
