Direktno brojanje mikroskopa za mikrobe
Eksperimentalni princip
Izravno brojanje pod mikroskopom pomoću hemocitometra često je korištena metoda brojanja mikroba. Prednost ove metode je što je intuitivna i brza. Stavite odgovarajuće razrijeđenu bakterijsku suspenziju (ili suspenziju spora) u komoru za brojanje između stakalca i pokrovnog stakla hemocitometra i brojite pod mikroskopom. Budući da je volumen komore za brojanje fiksan (0.1mm2), može se pretvoriti u ukupni broj mikroorganizama po jedinici volumena prema broju mikroorganizama promatranih pod mikroskopom. Budući da ova metoda broji zbroj živih i mrtvih bakterija, naziva se i metoda ukupnog broja bakterija.
Hemocitometar je obično posebno staklo na kojem četiri utora tvore tri platforme. Platforma u sredini podijeljena je na dvije polovice kratkim vodoravnim žlijebom. Na platformi sa svake strane je ugravirana mreža. Svaka mreža podijeljena je na devet velikih kvadrata. Veliki trg u sredini je soba za brojanje. Mikroorganizmi se broje u komori za brojanje. Struktura ploče za brojanje krvnih stanica prikazana je na slici Ⅷ-1.
Ljestvica sobe za brojanje općenito ima dvije specifikacije, jedna je da je veliki kvadrat podijeljen na 16 srednjih kvadrata, a svaki srednji kvadrat je podijeljen na 25 malih kvadrata (slika Ⅷ-2); drugi je veliki kvadrat. Kvadrat je podijeljen na 25 srednjih kvadrata, a svaki srednji kvadrat je podijeljen na 16 malih kvadrata (slika Ⅷ-1, C). Ali bez obzira o kojoj se vrsti ploče za brojanje radi, broj malih polja u svakom velikom kvadratu je isti, to jest 16×25=400 malih polja, kao što je prikazano na slici Ⅷ-2.
Duljina stranice svakog velikog kvadrata je 1 mm, a površina svakog velikog kvadrata je 1 mm2. Nakon što je pokrovno staklo pokriveno, visina između predmetnog stakla i pokrovnog stakla je 0.1 mm, tako da je volumen komore za brojanje 0.1 mm3.
Kada brojite, obično izbrojite ukupan broj bakterija u pet srednjih kvadrata, zatim dobijete prosječnu vrijednost svakog srednjeg kvadrata, a zatim pomnožite sa 16 ili 25 da biste dobili ukupan broj bakterija u velikom kvadratu, a zatim pretvorite u ukupan broj bakterija u 1 ml otopine bakterija.
Laboratorijska oprema
Hemocitometar, mikroskop, pokrovno stakalce, sterilna kapilara;
Eksperimentalni materijali
Suspenzija Saccharomyces cerevisiae
Eksperimentalni postupak (metoda izravnog brojanja mikrobnim mikroskopom)
1. razrjeđivanje
Pravilno razrijedite suspenziju Saccharomyces cerevisiae. Ako bakterijska otopina nije gusta, ne treba je razrjeđivati.
2. Mikroskopska soba za brojanje
Prije dodavanja uzoraka izvršite mikroskopski pregled komore za brojanje ploče za brojanje. Ako ima prljavštine, potrebno ju je očistiti prije brojanja.
3. dodati uzorak
Pokrijte čistu i suhu hemocitometarsku pločicu pokrovnim staklom, a zatim sterilnom finom kapaljkom nakapajte malu kap razrijeđene otopine Saccharomyces cerevisiae s ruba pokrovnog stakla (ne previše), tako da otopina bakterija je blizu razmaka uz razmak. Kapilarna osmoza sama ulazi u komoru za brojanje, a opća komora za brojanje može se napuniti bakterijskom tekućinom. Pazite da ne bude mjehurića zraka.
4. mikroskopsko brojanje
Nakon odmora od 5 minuta, postavite hemocitometar na postolje mikroskopa, najprije upotrijebite leću male jakosti da pronađete mjesto komore za brojanje, a zatim prijeđite na leću velike jakosti za brojanje. Ako se prije brojanja ustanovi da je bakterijska otopina pregusta ili prerijetka, potrebno je ponovno podesiti razrjeđenje prije brojanja. Općenito, za razrjeđivanje uzorka potrebno je oko 5-10 bakterija u svakoj stanici. Svaka komora za brojanje odabire bakterije u 5 srednjih rešetki (po izboru 4 kutne i središnje rešetke) za brojanje. Bakterije na crti mreže općenito se broje samo na gornjoj i desnoj liniji. U slučaju pupanja kvasca, kada veličina tijela pupoljka dosegne polovicu matične stanice, izbrojite dvije bakterije. Prebrojite uzorak kako biste izračunali sadržaj bakterija u uzorku iz vrijednosti izbrojanih u dvije komore za brojanje.
5. Čišćenje hemocitometra
Ploču za brojanje krvnih zrnaca na slavini nakon upotrebe isperite mlazom vode, nemojte je prati tvrdim predmetima, a nakon pranja je osušite sami ili sušilom za kosu. Mikroskopskim pregledom, promatrajte postoje li zaostale bakterije ili drugi sedimenti u svakoj stanici. Ako nije čist, mora se više puta prati dok ne bude čist.
