Povećanje prednosti laserske skenirajuće multifotonske mikroskopije
Laserska skenirajuća multifotonska mikroskopija veliko je poboljšanje u odnosu na optičku mikroskopiju. Može promatrati duboku strukturu živih stanica, fiksnih stanica i tkiva, te može dobiti jasne i oštre višeslojne strukture Z ravnine, odnosno optičke presjeke, iz kojih može konstruirati trodimenzionalnu čvrstu strukturu uzorka. Konfokalna mikroskopija koristi laserski izvor svjetlosti koji, nakon ekspanzije, ispunjava cijelu stražnju žarišnu ravninu leće objektiva, a zatim prolazi kroz sustav leća objektiva da bi konvergirao u vrlo malu točku na žarišnoj ravnini uzorka. Ovisno o numeričkoj aperturi leće objektiva, promjer najsvjetlije točke osvjetljenja je oko 0.25 ~ 0.8μm, a dubina je oko 0.5 ~ 1.5μm . Veličina konfokalne točke ovisi o dizajnu mikroskopa, valnoj duljini lasera, karakteristikama objektiva, postavkama statusa jedinice za skeniranje i svojstvima uzorka. Terenska mikroskopija ima veliki raspon osvjetljenja i dubinu, dok konfokalna mikroskopija ima fokusirano osvjetljenje fokusirano na žarišnu točku u žarišnoj ravnini. Najosnovnija prednost konfokalne mikroskopije je da može izvesti fino optičko rezanje debelih fluorescentnih uzoraka (koji mogu doseći 50 μm ili više), a debljina sekcija je oko 0,5 do 1,5 μm. Niz slika optičkih presjeka može se dobiti pomicanjem uzorka gore-dolje pomoću koračnog motora Z-osi mikroskopa. Prikupljanje slikovnih informacija kontrolira se unutar ravnine i neće biti ometano signalima emitiranim s drugih mjesta na uzorku. Nakon uklanjanja utjecaja pozadinske fluorescencije i povećanja omjera signala i šuma, kontrast i razlučivost konfokalnih slika značajno su poboljšani u usporedbi s tradicionalnim fluorescentnim slikama osvijetljenim poljem. U mnogim uzorcima, mnoge su zamršene strukturne komponente isprepletene kako bi tvorile složene sustave, ali jednom kada se prikupi dovoljno optičkih presjeka, možemo ih rekonstruirati u tri dimenzije pomoću softvera. Ova eksperimentalna metoda naširoko se koristi u biološkim istraživanjima za razjašnjavanje složenih strukturnih i funkcionalnih odnosa između stanica ili tkiva.
