Fluorescentna mikroskopija razlikuje se od konvencionalne mikroskopije
Fluorescentni mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti za zračenje predmeta koji se pregledava, tako da objekt emitira svjetlost, a zatim promatraju predmet pod mikroskopom. Uglavnom se koristi za imunofluorescentne stanice. Uglavnom se sastoji od izvora svjetlosti, sustava filtarske ploče i optičkog sustava za promatranje fluorescentne slike uzorka kroz povećanje okulara i objektiva. Pogledajmo razliku između ovog fluorescentnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa.
1. Pogledajte način osvjetljenja
Metoda osvjetljavanja fluorescentnog mikroskopa općenito je episkopska, što znači da se izvor svjetlosti projicira na ispitni uzorak kroz leću objektiva.
2. Pogledajte rezoluciju
Fluorescentni mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti, a valna duljina je relativno kratka, ali je rezolucija veća od one kod običnih optičkih mikroskopa.
3. Razlika u filteru
Fluorescentni mikroskopi koriste dva posebna filtera, koji se koriste ispred izvora svjetlosti za filtriranje vidljive svjetlosti, a koriste se između objektiva i okulara za filtriranje ultraljubičastih zraka, koje mogu zaštititi ljudske oči.
Fluorescentni mikroskop također je vrsta optičkog mikroskopa, uglavnom zato što je valna duljina koju pobuđuje fluorescentni mikroskop kratka, pa to dovodi do razlike u strukturi i upotrebi između fluorescentnog mikroskopa i običnog mikroskopa. Većina fluorescentnih mikroskopa ima dobru funkciju hvatanja slabog svjetla, tako da je pod izrazito slabom fluorescencijom njihova sposobnost snimanja također dobra. Zajedno sa stalnim poboljšanjem fluorescentnih mikroskopa posljednjih godina, buka je također znatno smanjena. Stoga se sve više koriste fluorescentni mikroskopi.
par
Poznavanje fotonske fluorescentne mikroskopije
Osnovni princip dvofotonske ekscitacije je: u slučaju velike gustoće fotona, fluorescentne molekule mogu apsorbirati dva fotona dugih valnih duljina u isto vrijeme, i emitirati foton kraće valne duljine nakon kratkog vremena života u takozvanom pobuđenom stanju; učinak je isti kao korištenje fotona s valnom duljinom upola manjom od dugovalne za pobuđivanje fluorescentnih molekula. Dvofotonska ekscitacija zahtijeva visoku gustoću fotona. Kako se stanice ne bi oštetile, dvofotonska mikroskopija koristi visokoenergetske impulsne lasere s zaključanim modom. Laser koji emitira ovaj laser ima visoku vršnu energiju i nisku prosječnu energiju, njegova širina pulsa je samo 100 femtosekundi, a njegova frekvencija može doseći 80 do 100 megaherca. Kada se koristi leća objektiva s velikim numeričkim otvorom za fokusiranje fotona pulsirajućeg lasera, gustoća fotona u žarišnoj točki objektiva je najveća, a dvofotonska ekscitacija javlja se samo u žarišnoj točki objektiva, tako da dvofotonski mikroskop ne zahtijeva konfokalnu rupicu, što poboljšava učinkovitost detekcije fluorescencije.
U općem fenomenu fluorescencije, zbog niske gustoće fotona pobudne svjetlosti, fluorescentna molekula može apsorbirati samo jedan foton u isto vrijeme, a zatim emitirati fluorescentni foton kroz prijelaz zračenja, što je jednofotonska fluorescencija. Za proces pobuđivanja fluorescencije koji koristi laser kao izvor svjetlosti, može doći do dvofotonske ili čak višefotonske fluorescencije. U ovom trenutku, intenzitet korištenog izvora pobudne svjetlosti je visok, a gustoća fotona zadovoljava zahtjeve fluorescentnih molekula koje apsorbiraju dva fotona u isto vrijeme. U procesu korištenja općeg lasera kao izvora pobudne svjetlosti, gustoća fotona još uvijek nije dovoljna da proizvede fenomen apsorpcije dva fotona. Obično se koristi femtosekundni pulsni laser, čija trenutna snaga može doseći reda veličine megavata. Zbog toga je valna duljina dvofotonske fluorescencije kraća od valne duljine pobudne svjetlosti, što je ekvivalentno učinku izazvanom pobudom na polovici valne duljine pobude.
Dvofotonska fluorescentna mikroskopija ima mnoge prednosti:
1) Na dugovalnu svjetlost manje utječe raspršenje nego na kratkovalnu svjetlost i lako prodire kroz uzorak;
2) Fluorescentne molekule izvan žarišne ravnine nisu pobuđene, tako da više pobudnog svjetla može doprijeti do žarišne ravnine, tako da pobudno svjetlo može prodrijeti dublje u uzorke;
3) Svjetlo duge valne duljine blisko infracrveno je manje toksično za stanice od svjetlosti kratke valne duljine;
4) Kada se za promatranje uzoraka koristi dvofotonski mikroskop, fotoizbjeljivanje i fototoksičnost pojavljuju se samo u žarišnoj ravnini. Stoga je dvofotonska mikroskopija prikladnija od jednofotonske mikroskopije za promatranje debelih uzoraka, za promatranje živih stanica ili za pokuse točkastog fotoizbjeljivanja.
Poznavanje konfokalne fluorescentne mikroskopije
Osnovno načelo konfokalne fluorescentne mikroskopije: uzorak se obasjava točkastim izvorom svjetlosti, a na žarišnoj ravnini formira se mala, dobro definirana svjetlosna točka. Nakon što je točka ozračena, leća objektiva prikuplja emitiranu fluorescenciju i šalje je natrag u razdjelnik snopa koji se sastoji od dikroičnog zrcala duž izvorne putanje osvjetljenja. Razdjelnik snopa šalje fluorescenciju izravno u detektor. Ispred izvora svjetlosti i detektora nalazi se rupica, koja se naziva rupica za osvjetljavanje i rupica za otkrivanje. Geometrijska veličina oba je ista, oko 100-200nm; u odnosu na svjetlosnu točku na žarišnoj ravnini, dvije su konjugirane, to jest, svjetlosna točka prolazi kroz niz leća, i na kraju se može fokusirati na rupicu za osvjetljavanje i rupicu za detekciju u isto vrijeme. Na taj način, svjetlost iz žarišne ravnine može biti konvergirana unutar opsega otvora za otkrivanje, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod žarišne ravnine blokirana izvan otvora za otkrivanje i ne može se prikazati. Laser skenira uzorak točku po točku, a fotomultiplikatorska cijev nakon otkrivanja rupice također dobiva konfokalnu sliku odgovarajuće svjetlosne točke točku po točku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi na računalo, te na kraju agregira u jasnu sliku. konfokalna slika cijele žarišne ravnine na ekranu.
Svaka slika žarišne ravnine zapravo je optički presjek uzorka, a taj optički presjek uvijek ima određenu debljinu, također poznatu kao optički tanki presjek. Budući da je intenzitet svjetla u žarišnoj točki puno veći od intenziteta u nefokusnoj točki, a svjetlost nežarišne ravnine filtrira se rupom, dubina polja konfokalnog sustava je približno nula, a skeniranje duž Z-os može realizirati optičku tomografiju, formirajući dvodimenzionalni optički presjek na fokusiranoj točki uzorka koji se promatra. Kombinacijom skeniranja XY ravnine (žarišne ravnine) sa skeniranjem Z-osi (optičke osi), trodimenzionalna slika uzorka može se dobiti akumulacijom dvodimenzionalnih slika kontinuiranih slojeva i obraditi posebnim računalnim softverom.
To jest, rupica za otkrivanje i rupica za izvor svjetlosti uvijek su fokusirane na istu točku, tako da fluorescencija pobuđena izvan žarišne ravnine ne može ući u rupicu za detekciju.
Jednostavan izraz principa rada laserskog konfokalnog lasera je da koristi lasersko svjetlo kao izvor svjetla. Na temelju tradicionalnog snimanja fluorescentnim mikroskopom, dodaje uređaj za lasersko skeniranje i uređaj za konjugirano fokusiranje, a to je sustav za digitalno prikupljanje slike i obradu putem računalne kontrole.
