Kako možete odabrati pravi konfokalni mikroskop za sebe? Postoji li neka posebna metoda?
Konfokalna mikroskopija ima više prednosti od mikroskopije širokog polja. Konfokalna mikroskopija može napraviti kontinuirano optičko rezanje uzoraka i isključiti interferenciju signala iz nežarišnih ravnina. Zbog toga je primjena konfokalne mikroskopije doista češća. No, na tržištu je sve više konfokalnih mikroskopa. Kako odabrati?
Konfokalna mikroskopija ima više prednosti od mikroskopije širokog polja. Konfokalna mikroskopija može napraviti kontinuirane optičke presjeke uzoraka i isključiti interferenciju signala iz nežarišnih ravnina. Zbog toga je konfokalna mikroskopija doista češća. No, na tržištu je sve više konfokalnih mikroskopa. Kako odabrati? Prilikom odabira konfokalnog mikroskopa postoje dva osnovna i važna razmatranja: vrsta uzorka koji želite proučavati (npr. fiksne ili žive stanice) i vrsta analize koju želite izvesti (npr. statični ili dinamički stanični procesi).
Konfokalna slika fiksnih stanica
Za slikanje fiksiranih i obojenih stanica ili tkiva općenito biramo konfokalno lasersko skeniranje (LSCM). To je uglavnom zato što fiksiranim mrtvim stanicama nedostaju brzi biološki događaji u živim stanicama i mogu bolje imati koristi od veće prostorne rezolucije LSCM-a. LSCM snimanje je optičko rezanje uzorka laserom, a brzina skeniranja (ovisno o brzini zrcala niza skeniranja) općenito je 1fps. Dulje vrijeme ekspozicije znači veći rizik od fotoizbjeljivanja, ali za fiksirane mrtve stanice vrijeme nije kritično i možemo ga izračunati prosječnim snimanjem više slika.
Konfokalno snimanje živih stanica
Snimanje živih stanica zahtijeva dodatnu zaštitu od nepovoljnih okolina. Prilikom snimanja, naša prva briga je održati vitalnost i zdravlje stanica. Elementi za grijanje konstantne temperature i perfuzijski sustavi bitni su, posebno za studije s vremenskim odmakom. Brzi biokemijski događaji koji kontroliraju fiziološko stanje živih stanica ono su što većina ljudi želi proučavati, ali ti su događaji prebrzi za konvencionalni LSCM. Osim toga, produljena izloženost LSCM-u također je izazvala oštećenje stanica toksičnim svjetlom. Stoga snimanje živih stanica zahtijeva posebne konfokalne mikroskope.
Općenito postoje dvije mogućnosti za konfokalno oslikavanje živih stanica: brzo skenirajuće lasersko skenirajuće konfokale i konfokale s rotirajućim diskom. Konfokalna mikroskopija s brzim skeniranjem zamjenjuje sporija zrcala galvanometra s bržim rezonantnim zrcalima za skeniranje, omogućujući brzine skeniranja do 30fps; dok konfokali s vrtećim diskovima (SDCM) imaju prednost bržeg skeniranja (iako neizbježno uz gubitak prostorne rezolucije), njihova brzina teoretski može doseći 2000fps (u praksi je često ograničena drugim čimbenicima).
Ako ste zabrinuti zbog fotoizbjeljivanja ili vrlo slabog fluorescentnog signala, SDCM bi mogao biti prikladniji. SDCM koristi dva rotirajuća diska s raspoređenim mikrojažicama za raspršivanje pobudne svjetlosti. Za razliku od LSCM-a, koji skenira točku uzorka, SDCM dobiva više točaka odjednom (oko 100 točaka piksela), tako da je brzina znatno povećana, a fotoizbjeljivanje SDCM-a i manja fototoksičnost. Međutim, također možete koristiti konfokale s brzim skeniranjem kako biste povećali brzinu skeniranja, u kombinaciji s visokoosjetljivim detektorima i smanjili pobudnu svjetlosnu energiju kako biste smanjili fototoksičnost, što može zadržati bogate funkcije tradicionalnih konfokala.
Automatizirani konfokalni sustav snimanja
Neki istraživači vole pronaći načine za modificiranje mikroskopa kako bi odgovarao njihovim individualnim potrebama. A neke istraživače niti ne zanima kako mikroskopi zapravo rade. Potonjima bi se više mogao svidjeti automatizirani konfokalni mikroskop. Na primjer, Olympus FluoViewFV10i takav je potpuno automatski stolni 4-laserski konfokalni mikroskop. Njegova kompaktna integrirana struktura ne zahtijeva gotovo nikakav prostor za ugradnju. Ova vrsta instrumenata idealna je za istraživače koji svakodnevno moraju prikupljati mnogo slikovnih podataka, ali naravno ne odražavaju u potpunosti funkcionalnost i fleksibilnost tradicionalnih konfokala. Osim toga, NikonA1 također je potpuno automatski konfokalni sustav. Kao i većina konvencionalnih konfokalnih skenirajućih mikroskopa, NikonA1 koristi galvanometarsku glavu za skeniranje, koja ima veću rezoluciju od A1R s hibridnom glavom za skeniranje, ali nešto sporiju brzinu (A1R ~30fps)
