Kako odabrati odgovarajući fluorescentni mikroskop
Fluorescencijski mikroskop standardna je oprema za mikroskopsko snimanje u laboratorijima i odjelima patologije, koja koristi karakteristike fluorescencije za promatranje i snimanje. Naširoko se koristi u raznim područjima kao što su stanična biologija, neurobiologija, botanika, mikrobiologija, patologija, genetika itd. Fluorescencijsko snimanje ima prednosti visoke osjetljivosti i specifičnosti, što ga čini vrlo prikladnim za promatranje distribucije specifičnih proteina, organela itd. .u tkivima i stanicama, proučavanje kolokalizacije i interakcija, praćenje životnih dinamičkih procesa kao što su promjene koncentracije iona, i tako dalje.
Izbor mikroskopa
Fluorescentni mikroskopi uglavnom se dijele u tri kategorije: uspravni fluorescentni mikroskopi (prikladni za rezanje), invertni fluorescentni mikroskopi (prikladni za žive stanice i također za rezanje) i stereo fluorescentni mikroskopi (prikladni za veće uzorke, poput biljaka, zebrica (odrasle/ embrionalni), medaka, organi miša/štakora itd.).
Odabir fluorescentnih filtarskih blokova
Odabir filtarskih blokova ne bi trebao uzeti u obzir samo valne duljine ekscitacije i emisije fluorescentnih sondi, već također razmotriti postoji li nespecifična ekscitacija i postoji li preslušavanje boja za višebojno označene uzorke. U eksperimentu ćemo odabrati valnu duljinu koja je najbliža ekscitacijskom vrhu što je više moguće za ekscitaciju, a prijemni raspon trebao bi uključivati vršnu emisiju. Vrh ekscitacije Alexa Fluor 488 je 500 nm, a filtar ekscitacije 480/40 može se odabrati u fluorescentnom mikroskopu. Uobičajeno korišteni blokovi fluorescentnog filtra u fluorescentnoj mikroskopiji mogu se podijeliti u dvije vrste: dugi prolaz (LP) i pojasni prolaz (BP), koje također treba odabrati prema potrebama.
Konfokalni mikroskop
U tradicionalnim promatranjima fluorescentnom mikroskopijom, zbog preklapanja fluorescentno obilježenih tvari i spontanih fluorescentnih struktura, one su međusobno čvrsto povezane. Međutim, tradicionalni padajući fluorescentni mikroskopski objektivi ne samo da skupljaju svjetlost iz žarišne ravnine, već i raspršuju svjetlost gore i dolje po žarišnoj ravnini, što rezultira značajnim smanjenjem rezolucije slike i kontrasta.
Konfokalno snimanje detektira samo svjetlo reflektirano od ravnine samofokusiranja, čime se rješava gornji problem. Izvor svjetlosti oblikuje malu i finu točku na žarišnoj ravnini kroz rupicu, a svjetlost emitirana iz žarišne ravnine skuplja se kroz leću objektiva. Većina fluorescencije emitirane iz točaka iznad ili ispod žarišne ravnine leće objektiva ne može konvergirati u rupicu. Samo fluorescencija koja se nalazi u žarišnoj ravnini i mali dio defokusirane fluorescencije mogu proći kroz rupicu, dok svjetlosni snop izvan žarišne ravnine konvergira ispred ili iza ploče s rupicama i blokiran je od ulaska u detektor kroz rupicu. Detektirana slika je iz žarišne ravnine, tako da je konačna kvaliteta slike znatno poboljšana.
Zbog raznih prednosti i praktičnosti laserske skenirajuće konfokalne mikroskopije, ona je trenutno nezamjenjiv eksperimentalni pomoćnik u visokopreciznoj staničnoj biologiji, botanici i područjima istraživanja stanica. Istovremeno, u budućim znanstveno-istraživačkim centrima, to će biti najosnovniji i temeljni istraživački alat.
