Kako odabrati pravi fluorescentni mikroskop
Fluorescentni mikroskop standardna je oprema za mikroskopsko snimanje u laboratorijima i odjelima patologije. Koristi karakteristike fluorescencije za promatranje i snimanje. Široko se koristi u staničnoj biologiji, neurobiologiji, botanici, mikrobiologiji, patologiji, genetici i drugim područjima. Prednosti fluorescentnog snimanja su visoka osjetljivost i visoka specifičnost te je vrlo pogodno za promatranje distribucije specifičnih proteina i organela u tkivima i stanicama, proučavanje kolokalizacije i interakcija, praćenje životnih dinamičkih procesa kao što su promjene koncentracije iona itd.
Izbor mikroskopa
Fluorescentni mikroskopi uglavnom se dijele u tri kategorije: uspravni fluorescentni mikroskopi (prikladni za rezanje), invertni fluorescentni mikroskopi (prikladni za žive stanice, uzimajući u obzir rezanje), stereoskopski fluorescentni mikroskopi (prikladni za veće uzorke, kao što su biljke, zebrice (odrasle/ embrij), medaka, organi miša/štakora itd.).
Izbor fluorescentnih filtarskih kockica
Uz razmatranje valnih duljina ekscitacije i emisije fluorescentnih sondi, odabir blokova filtera također treba uzeti u obzir postoji li nespecifična ekscitacija i križna boja za višebojno označene uzorke. U eksperimentu ćemo pokušati odabrati valnu duljinu koja je najbliža ekscitacijskom vrhu za ekscitaciju, a raspon primanja mora uključivati emisioni vrh. Na primjer, vrhunac ekscitacije Alexa Fluor 488 je 500 nm, a filtar ekscitacije 480/40 može se odabrati u fluorescentnom mikroskopu. Kocke fluorescentnog filtra koje se obično koriste u fluorescentnim mikroskopima mogu se podijeliti u dvije vrste: dugi prolaz (LP za kratko) i band pass (BP za kratko), koje također treba odabrati prema potrebama.
Izbor izvora fluorescentnog svjetla
Trenutačno korišteni fluorescentni izvori svjetlosti uključuju živine žarulje, metalhalogene žarulje i LED izvore svjetlosti koji su se brzo razvili posljednjih godina. Spektar fluorescentnog izvora svjetlosti je kontinuiran i diskontinuiran, a energija će biti različita u različitim pojasima. Zbog relativno uskog spektralnog pojasa, stabilnijeg izlaza energije, dugog životnog vijeka, sigurnosti i zaštite okoliša te mnogih drugih prednosti, LED izvor svjetlosti postupno postaje glavni izvor svjetlosti fluorescentnog mikroskopa.
konfokalni mikroskop
U tradicionalnom promatranju fluorescentnim mikroskopom, zbog preklapanja fluorescentnih markera i autofluorescentnih struktura, oni su usko kombinirani, dok tradicionalna epi-fluorescentna mikroskopska objektivna leća ne samo da skuplja svjetlost iz žarišne ravnine, već i raspršenu svjetlost iznad i ispod žarišnoj ravnini, što rezultira znatno smanjenom rezolucijom i kontrastom slike.
Konfokalno snimanje rješava ovaj problem otkrivanjem samo dijela svjetlosti reflektiranog od žarišne ravnine. Izvor svjetlosti prolazi kroz rupicu i oblikuje malu i finu svjetlosnu točku na žarišnoj ravnini. Svjetlost koja se emitira iz žarišne ravnine prikuplja leća objektiva. Većina fluorescencije emitirane iz točke iznad ili ispod žarišne ravnine leće objektiva ne može konvergirati u malu rupicu. Samo fluorescencija koja se nalazi u žarišnoj ravnini i mali dio fluorescencije izvan fokusa mogu proći kroz rupicu, dok se svjetlosne zrake izvan žarišne ravnine skupljaju na prednjoj ili stražnjoj strani ploče s rupicama i blokiraju se od ulaska u detektor kroz rupica. Detektirana slika je slika iz žarišne ravnine, tako da je konačna kvaliteta slike znatno poboljšana.
Zbog prednosti i izvedivosti funkcija laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa, konfokalni mikroskop nezaobilazan je eksperimentalni pomoćnik u području visokoprecizne stanične biologije, botanike i istraživanja stanica. Ujedno, u budućem znanstveno-istraživačkom centru, to će biti najosnovniji i temeljni znanstveno-istraživački alat.
