Uvod u glavna područja primjene optičkog mikroskopa
Optički mikroskop je staro i mlado znanstveno sredstvo. Ima povijest dugu 300 godina od svog rođenja. Optički mikroskop ima široku primjenu. Primjerice, u biologiji, kemiji, fizici, astronomiji itd. neodvojiv je od mikroskopa u nekom znanstveno-istraživačkom radu.
Prema različitim namjenama primjene, mikroskopi se mogu grubo klasificirati u četiri kategorije: biološki mikroskopi, metalografski mikroskopi, stereo mikroskopi i polarizacijski mikroskopi. Kao što naziv implicira, biološki mikroskopi uglavnom se koriste u biomedicini, a objekti promatranja uglavnom su prozirna ili prozirna mikrotijela; metalografski mikroskopi se uglavnom koriste za promatranje površine neprozirnih predmeta, kao što su metalografska struktura i površinski defekti materijala; dok stereoskopski mikroskopi povećavaju mikro-objekte, oni također stvaraju objekte i slike u istom smjeru u odnosu na ljudsko oko i imaju osjećaj dubine, što je u skladu s konvencionalnim vizualnim navikama ljudi; polarizacijski mikroskopi koriste karakteristike prijenosa ili refleksije različitih materijala za polarizirano svjetlo kako bi razlikovali različite komponente mikroobjekata. Osim toga, neke posebne vrste također se mogu dodatno podijeliti. Na primjer, invertirani biološki mikroskop ili mikroskop kulture je biološki mikroskop koji se uglavnom koristi za promatranje kulture kroz dno posude za kulturu; fluorescentni mikroskop koristi karakteristike određenih tvari za apsorbiranje svjetlosti određene kraće valne duljine i emitiranje svjetlosti određene duže valne duljine kako bi otkrio postojanje tih tvari i odredio njihov sadržaj; usporedni mikroskop može oblikovati jukstaponirane ili superponirane slike dvaju objekata u istom vidnom polju kako bi se usporedile sličnosti i razlike između dva objekta.
Tradicionalni optički mikroskopi uglavnom se sastoje od optičkih sustava i njihovih pratećih mehaničkih struktura. U optičke sustave spadaju leće objektiva, okulari i sabirne leće, a sve su to komplicirana povećala izrađena od različitih optičkih stakala. Leća objektiva povećava uzorak, a njegovo povećanje Mobject određeno je sljedećom formulom: Mobject =Δ∕f'object, gdje je f'object žarišna duljina leće objektiva, a Δ se može shvatiti kao udaljenost između objektiva i okulara. Okular ponovno povećava sliku koju stvara leća objektiva, stvarajući virtualnu sliku na 250 mm ispred ljudskog oka za promatranje. Ovo je najudobniji položaj za promatranje za većinu ljudi. Povećanje okulara M=250/f' oko, gdje je f' žarišna duljina okulara. Ukupno povećanje mikroskopa umnožak je leće objektiva i okulara, odnosno M=M objekt*M oko=Δ*250/f' oko *f; objekt. Vidi se da će smanjenje žarišne duljine leće objektiva i okulara povećati ukupno povećanje, što je ključno za viđenje bakterija i drugih mikroorganizama mikroskopom, a ujedno je i razlika između njega i običnih povećala.
Dakle, je li zamislivo smanjiti f' objekt f' mrežu bez ograničenja, kako bi se povećalo povećanje, tako da možemo vidjeti suptilnije objekte? Odgovor je ne! To je zato što je svjetlost koja se koristi za snimanje u biti vrsta elektromagnetskog vala, pa će se tijekom procesa širenja neizbježno pojaviti fenomeni difrakcije i interferencije, baš kao što se valovi na površini vode koji se mogu vidjeti u svakodnevnom životu mogu vrtjeti okolo kada naiđete na prepreke , a dva stupca vodenih valova mogu ojačati ili oslabiti jedan drugog kada se susretnu. Kada svjetlosni val emitiran iz točkastog svjetlećeg objekta uđe u leću objektiva, okvir leće objektiva sprječava širenje svjetlosti, što dovodi do difrakcije i interferencije. Nakon prolaska kroz leću objektiva više se ne može skupiti u jednoj točki, već stvara svjetlosnu mrlju određene veličine, a na periferiji se nalazi niz svjetlosnih prstenova slabog i postupno slabljećeg intenziteta. Središnju svijetlu točku nazivamo Airyjev disk. Kada su dvije točke emitiranja svjetlosti blizu određene udaljenosti, dvije svjetlosne točke će se preklapati sve dok se ne mogu prepoznati kao dvije svjetlosne točke. Rayleigh je predložio standard prosudbe, misleći da kada je udaljenost između središta dviju svjetlosnih točaka jednaka radijusu Airyjevog diska, dvije svjetlosne točke se mogu razlikovati. Nakon izračuna, udaljenost između dviju točaka emitiranja svjetlosti u ovom trenutku je e=0.61 In/n.sinA=0.61 In/NA U formuli, In je valna duljina svjetlosti, a valna duljina svjetlosti koju može primiti ljudsko oko je oko 0.4-0.7um, a n je indeks loma medija u kojem se nalazi točka emitiranja svjetlosti. Na primjer, u zraku, n≈1, u vodi, n≈1,33, a A je polovica kuta otvora luminiscentne točke prema okviru leće objektiva, a NA se naziva numerička apertura leće objektiva. Iz gornje formule vidljivo je da je udaljenost između dviju točaka koju leća objektiva može razlikovati ograničena valnom duljinom svjetlosti i numeričkim otvorom blende. Budući da je valna duljina najosjetljivijeg ljudskog oka oko 0.5um, a kut A ne može prijeći 90 stupnjeva, sinA je uvijek manji od 1. Maksimalni indeks loma dostupnog prijenosa svjetlosti medij je oko 1,5, tako da je vrijednost e uvijek veća od 0.2um, što je minimalna granična udaljenost koju može razlučiti optički mikroskop. Povećajte sliku kroz mikroskop. Ako želite povećati udaljenost točke objekta e koju leća objektiva može razlučiti s određenom NA vrijednošću dovoljnom da je razluči ljudsko oko, trebate Me Veće od ili jednako 0.15mm, gdje { {29}}.15 mm minimalna je udaljenost između dva mikroobjekta koje ljudsko oko može razlikovati na 250mm ispred vaših očiju, tako da M Veće ili jednako (0,15∕0,61)NA ≈500N.A. Dovoljno je udvostručiti povećanje, odnosno 500N.A Manje ili jednako M Manje ili jednako 1000N.A, što je razuman raspon odabira ukupnog povećanja mikroskopa. Koliko god ukupno povećanje bilo, ono je besmisleno, jer je numerički otvor leće objektiva ograničio minimalnu razlučivu udaljenost, te je povećanjem povećanja nemoguće razlučiti manje detalje predmeta.
Kontrast slike još je jedno ključno pitanje u optičkim mikroskopima. Takozvani kontrast odnosi se na crno-bijeli kontrast ili razliku u boji između susjednih dijelova na površini slike. Ljudskom oku je teško procijeniti razliku svjetline ispod 0.02, ali malo je osjetljivije na razliku u boji. Neki mikroskopski objekti, poput bioloških uzoraka, imaju vrlo malu razliku u svjetlini između detalja, a pogreške u dizajnu i proizvodnji optičkog sustava mikroskopa dodatno smanjuju kontrast slike i otežavaju razlikovanje. U ovom trenutku detalji objekta se ne mogu jasno vidjeti.
Tijekom godina ljudi su naporno radili na poboljšanju rezolucije i kontrasta slike mikroskopa. Sa stalnim napretkom računalne tehnologije i alata, teorija i metode optičkog dizajna također su kontinuirano poboljšane. Zajedno s poboljšanjem performansi sirovina, stalnim poboljšanjem tehnologije i metoda detekcije, te inovacijama metoda promatranja, kvaliteta slike optičkog mikroskopa približila se savršenstvu granice difrakcije. Ljudi će koristiti bojenje uzorka, tamno polje, fazni kontrast, fluorescenciju, interferenciju i polarizirano svjetlo. Instrumenti za snimanje izlaze jedan za drugim i imaju superiorne performanse u nekim aspektima, ali još uvijek se ne mogu natjecati s optičkim mikroskopima u smislu jeftinosti, praktičnosti, intuicije i posebno prikladnosti za istraživanje živih organizama. Optički mikroskopi još uvijek čvrsto zauzimaju svoje pozicije. S druge strane, u kombinaciji s laserom, računalom, tehnologijom novih materijala i informacijskom tehnologijom, drevni optički mikroskop se pomlađuje i pokazuje snažnu vitalnost. Digitalni mikroskopi, laserski konfokalni skenirajući mikroskopi, skenirajući mikroskopi bliskog polja, dvofotonski mikroskopi i instrumenti s raznim novim funkcijama ili koji se mogu prilagoditi raznim novim uvjetima okoline pojavljuju se u beskonačnom nizu, što dodatno proširuje područje primjene optičkih mikroskopa, kao primjeri. Kako su samo uzbudljive mikroskopske slike kamenih formacija koje su učitali marsohodi! Možemo u potpunosti vjerovati da će optički mikroskop koristiti čovječanstvu s ažuriranim stavom.
