Poznavanje konfokalnog fluorescentnog mikroskopa
Osnovno načelo konfokalne fluorescentne mikroskopije: točkasti izvor svjetlosti koristi se za ozračivanje uzorka, tvoreći malu, dobro definiranu svjetlosnu točku na žarišnoj ravnini; fluorescenciju emitiranu iz ove točke nakon ozračivanja prikuplja leća objektiva i šalje natrag duž izvorne putanje svjetlosti ozračivanja do djelitelja snopa koji se sastoji od dvosmjernog kromatskog zrcala. Razdjelnik snopa šalje fluorescenciju izravno u detektor. I izvor svjetlosti i detektor imaju rupicu ispred sebe, koja se naziva rupica za osvjetljavanje i rupica za otkrivanje. Obje imaju istu geometriju, oko 100-200 nm, i konjugirane su u odnosu na točku svjetlosti na žarišnoj ravnini, tj. točka svjetlosti prolazi kroz niz leća i na kraju se može fokusirati na obje osvjetljavajuće i rupice detektora. Na taj način, svjetlost iz žarišne ravnine može konvergirati unutar otvora sonde, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod žarišne ravnine blokirana izvan otvora sonde i ne može se prikazati. Laser skenira uzorak točku po točku, a fotomultiplikatorska cijev nakon detekcije rupice također dobiva konfokalnu sliku odgovarajuće svjetlosne točke točku po točku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi u računalo, te na kraju konvergira u jasnu sliku. konfokalna slika cijele žarišne ravnine na ekranu.
Svaka slika u žarišnoj ravnini zapravo je optički presjek uzorka, a taj optički presjek uvijek ima određenu debljinu, također poznatu kao optička ploča. Budući da je intenzitet svjetlosti u žarišnoj točki puno veći od intenziteta u nežarišnoj točki, a svjetlost nežarišne ravnine filtrira se rupom, dubina polja konfokalnog sustava aproksimirana je na nuli, a skeniranje duž smjera Z-osi omogućuje optičkoj tomografiji da oblikuje dvodimenzionalni optički presjek uzorka koji se promatra na žarištu. Kombinacijom skeniranja XY ravnine (žarišne ravnine) sa skeniranjem Z-osi (optičke osi), trodimenzionalna slika uzorka može se dobiti skupljanjem uzastopnih slojeva dvodimenzionalnih slika, koje obrađuje specijalizirani računalni softver.
To znači da su rupica za otkrivanje i rupica za izvor svjetlosti uvijek fokusirane na istu točku, tako da fluorescencija pobuđena izvan žarišne ravnine ne može ući u rupicu za detekciju.
Princip rada laserskog konfokalnog lasera jednostavno je izražen da koristi laser kao izvor svjetlosti, na temelju tradicionalnog snimanja fluorescentnim mikroskopom, dodatnog laserskog uređaja za skeniranje i konjugiranog uređaja za fokusiranje, putem računalne kontrole za izvođenje sustava za prikupljanje i obradu digitalne slike.
