Znanja vezana uz konfokalnu fluorescentnu mikroskopiju
Osnovno načelo konfokalne fluorescentne mikroskopije je korištenje točkastog izvora svjetlosti za ozračivanje uzorka, formirajući dobro definiranu malu točku na žarišnoj ravnini. Fluorescenciju koju emitira točka nakon zračenja prikuplja leća objektiva i šalje natrag u spektrofotometar koji se sastoji od dvosmjernog zrcala u boji duž izvorne putanje zračenja. Spektrofotometar šalje fluorescenciju izravno na detektor. Postoje dvije rupice ispred izvora svjetlosti i detektora, koje se nazivaju rupice za osvjetljavanje i rupice za otkrivanje. Geometrijske dimenzije ove dvije su dosljedne, oko 100-200nm; U usporedbi sa svjetlosnom točkom na žarišnoj ravnini, dvije su konjugirane, što znači da svjetlosna točka prolazi kroz niz leća i na kraju se može istovremeno fokusirati i na rupicu za osvjetljavanje i na rupicu za detekciju. Na taj način, svjetlost iz žarišne ravnine može konvergirati unutar raspona detekcijske rupe, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod žarišne ravnine blokirana izvan detekcijske rupe i ne može se prikazati. Skeniranjem uzorka točku po točku laserom, fotomultiplikatorska cijev nakon detekcije rupice također dobiva odgovarajuću konfokalnu sliku svjetlosne točke točku po točku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi na računalo. Na kraju se na zaslonu sintetizira jasna konfokalna slika cijele žarišne ravnine.
Svaka slika u žarišnoj ravnini zapravo je optički presjek uzorka, koji uvijek ima određenu debljinu, poznatu i kao optički tanki presjek. Zbog činjenice da je intenzitet svjetla u žarišnoj točki mnogo veći od onog u nežarišnoj točki, a svjetlost nežarišne ravnine filtrira se rupicama, dubina polja konfokalnog sustava je približno nula. Skeniranjem duž smjera Z-osi može se postići optička tomografija, formirajući dvodimenzionalni optički presjek na žarišnoj točki promatranog uzorka. Kombinacijom skeniranja XY ravnine (žarišne ravnine) sa skeniranjem Z-osi (optičke osi), trodimenzionalna slika uzorka može se dobiti gomilanjem kontinuiranih slojeva dvodimenzionalnih slika i njihovom obradom pomoću specijaliziranog računalnog softvera.
Rupica za otkrivanje i rupica izvora svjetlosti uvijek su fokusirane na istu točku, tako da fluorescencija pobuđena izvan ravnine fokusiranja ne može ući u rupicu za detekciju.
Jednostavan izraz principa rada laserske konfokalne mikroskopije je da koristi laser kao izvor svjetlosti i dodaje laserski uređaj za skeniranje i konjugirani uređaj za fokusiranje na temelju tradicionalnog snimanja fluorescentnom mikroskopijom. To je sustav kojim upravlja računalo za digitalno prikupljanje i obradu slike.
