Učionica mikroskopske slike 丨 Primjena fluorescentne mikroskopije
Fluorescencijska mikroskopija s potpunom unutarnjom refleksijom (TIRFM) tehnika je koja koristi evanescentni val koji stvara svjetlosna zraka koja se širi između dva medija s različitim indeksom loma za ispitivanje površine fluorescentno obilježenih živih stanica. U praksi, kada upadna laserska zraka naiđe na sučelje između pokrovnog stakalca i vodenog medija koji sadrži stanice, reflektira se pod kritičnim kutom (potpuna unutarnja refleksija). Budući da energija evanescentnog vala eksponencijalno opada s udaljenošću od pokrovnog stakalca, samo fluorofori unutar 10 nanometara od površine (između 10 i 200 nanometara) su pobuđeni evanescentnim valom, dok su fluorofori dalje uglavnom nepobuđeni. Pogođeni. Stoga TIRFM rezultira visokim razinama signala iz fluorofora smještenih u blizini pokrovnog stakalca, superponiranih na vrlo tamnu pozadinu, pružajući izvrstan omjer signala i šuma. Ekstremno ograničenje dubine ekscitacije idealno je za proučavanje pojedinačnih molekula ili sastava membrane i organela u priraslim stanicama blizu površine pokrovnog stakalca (vidi sliku 8(e)). Budući da je ekscitacija ograničena na tanka područja u blizini pokrovnog stakalca, fotoizbjeljivanje i fototoksičnost također su ograničeni na ta područja, što TIRFM čini jednom od najkorisnijih metoda za dugoročno promatranje. Tehnika je postala temeljni alat za proučavanje širokog spektra fenomena u staničnoj i molekularnoj biologiji.
Dekonvolucija je algoritam primijenjen na skup slika sa svim fokusima dobivenih duž optičke (Z) osi kako bi se poboljšao fotonski signal u nizu slika za danu ravninu slike ili više žarišnih ravnina. Mikroskopi moraju biti opremljeni motoriziranim pogonima za fokusiranje visoke preciznosti kako bi se jamčilo dobivanje slike u točno određenim intervalima između žarišnih ravnina uzorka. U tipičnoj primjeni (vidi sliku 8(f)), proces dekonvolucije koristi se za uklanjanje zamućenja i uklanjanja svjetlosti izvan fokusa iz dane žarišne ravnine pomoću ekscitacije i emisije fluorescencije širokog polja. Najsloženija primjena je primjena procesa dekonvolucije na cijeli niz slika za generiranje projiciranih prikaza ili 3D modela. Skup slika širokog polja korištenih za dekonvoluciju bilježi teorijski najveći broj fotona koje emitira uzorak. Proces dekonvolucije redistribuira "zamućene" intenzitete fotona emitiranih iznad i ispod žarišne ravnine natrag na izvornu ravninu. Dakle, dekonvolucija koristi gotovo sve dostupne intenzitete emisije i osigurava optimalan proračun svjetlosti, čineći ovu tehniku metodom izbora za uzorke vrlo osjetljive na svjetlo.
Varijanta fenomena rezonantnog prijenosa energije na fluorescentnoj mikroskopiji, fluorescentni ili Försterov rezonantni prijenos energije (FRET) koristi se za dobivanje kvantitativnih vremenskih i prostornih informacija o vezanju i interakciji proteina, lipida, enzima i nukleinskih kiselina u živim stanicama. FRET može koristiti ili tehnike konstantnog stanja ili vremenski razlučne tehnike, ali vremenski razlučna FRET slika ima prednost preciznijeg mapiranja udaljenosti donora i akceptora. Standardni fluorescentni mikroskop širokog polja opremljen odgovarajućim ekscitacijskim i emisijskim filtrima i osjetljivom kamerom može se koristiti za FRET snimanje. Biosenzori koji stavljaju protein ili peptid osjetljiv na okoliš između dva fluorescentna proteina primjenjiva na FRET trenutno se široko koriste u staničnoj biologiji. Ove se sonde lako snimaju fluorescentnom mikroskopijom širokog polja korištenjem tehnika senzibilizirane emisije FRET u kombinaciji s raciometrijskom analizom. Osim toga, spektralno oslikavanje i linearno razdvajanje pomoću laserske skenirajuće konfokalne mikroskopije može pomoći u praćenju FRET fenomena u biosenzorima i drugim primjenama fluorescentnih proteina.
Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) je sofisticirana tehnika koja može istovremeno bilježiti životni vijek fluorescencije i prostornu lokaciju fluorofora na svakom mjestu na slici. Ova metoda pruža mehanizam za proučavanje parametara okoliša kao što su pH, ionska koncentracija, polaritet otapala, nekovalentne interakcije, viskoznost i napetost kisika u pojedinačnim živim stanicama i prikazuje podatke u prostornim i vremenskim nizovima. FLIM mjerenja trajanja pobuđenog stanja na skali nanosekunde neovisna su o lokalnim koncentracijama fluorofora, učincima fotoizbjeljivanja i duljini puta (debljina uzorka), ali su osjetljiva na reakcije pobuđenog stanja kao što je rezonantni prijenos energije. Zapravo, kombiniranje FLIM-a s FRET-om praćenjem promjena životnog vijeka fluorescentnih donora prije i nakon prijenosa rezonantne energije smatra se jednim od najboljih načina proučavanja ovog fenomena.
Mobilnost (koeficijent transverzalne difuzije) fluorescentno obilježenih makromolekula i malih fluorofora može se odrediti tehnikom oporavka fluorescencije nakon fotoizbjeljivanja (FRAP). U FRAP-u, vrlo malo odabrano područje (promjera nekoliko mikrometara) intenzivno se osvjetljava, obično laserom, kako bi se proizvelo potpuno fotoizbjeljivanje fluorofora u tom području. Rezultat je dramatično smanjenje ili nestanak fluorescencije. Nakon pulsa fotoizbjeljivanja, brzina i opseg oporavka intenziteta fluorescencije u izbijeljenim područjima praćeni su kao funkcija vremena pri niskim intenzitetima pobuđivanja kako bi se dobile informacije o kinetici repopulacije i oporavka fluorofora (Slika 9). FRAP se obično izvodi pomoću EGFP ili drugih fluorescentnih proteina. Povezane tehnike fotoaktivacije temelje se na posebnim sintetskim kaveznim fluoroforima ili sličnim funkcionalnim fluorescentnim proteinima koji se mogu aktivirati kratkim pulsevima UV ili ljubičaste boje. Fotoaktivacija i FRAP mogu se koristiti kao komplementarne tehnike za određivanje parametara mobilnosti.
U tehnici povezanoj s FRAP-om, koja se naziva gubitak fluorescencije nakon fotoizbjeljivanja (FLIP), definirana fluorescentna regija unutar žive stanice podvrgava se ponovljenom fotoizbjeljivanju intenzivnim zračenjem. Kad bi svi fluorofori mogli difundirati u područje koje je fotoizbjeljivano tijekom mjerenog vremenskog razdoblja, to bi rezultiralo potpunim gubitkom fluorescentnog signala u cijeloj ćeliji. Izračunavanjem brzine nestanka fluorescencije iz cijele stanice može se odrediti difuzijska pokretljivost ciljanog fluorofora. Osim toga, FLIP može lako identificirati mjesto i prirodu bilo koje difuzijske barijere između pojedinačnih odjeljaka stanica, kao što je barijera između some i aksona neurona.
Fluorescencijska korelacijska spektroskopija (FCS), koja se uglavnom koristi u laserskoj skenirajućoj konfokalnoj mikroskopiji ili multifotonskoj mikroskopiji, metoda je dizajnirana za određivanje kinetičkih informacija kao što su brzine kemijske reakcije, koeficijenti difuzije, tehnike za molekularnu težinu, brzinu protoka i agregaciju. U FCS-u, mali volumen (približno jedan femtometar; difrakcijski ograničeni fokus lasera) osvijetljen je fokusiranom laserskom zrakom kako bi se zabilježile fluktuacije intenziteta autofluorescencije izazvane dinamikom fluorescentnih molekula kao funkcije vremena u volumenu koji zauzima fluorescentna svjetlost. molekule (slika 10). Relativno mali fluorofori brzo difundiraju u osvijetljenom volumenu, stvarajući kratke udare nasumičnog intenziteta. Nasuprot tome, veći kompleksi (fluorofori vezani za makromolekule) pomiču se sporije, proizvodeći dulje, postojanije obrasce intenziteta fluorescencije ovisne o vremenu.
Kada su fluorescentno obilježene strukture gusto zbijene i preklapaju se u određenim regijama živih stanica, njihovu dinamiku i prostornu distribuciju teško je analizirati. Fluorescentna točkasta mikroskopija (FSM) tehnika je kompatibilna s gotovo svim modalitetima snimanja koja iskorištava vrlo niske koncentracije fluorescentno obilježenih podjedinica, smanjuje fluorescenciju izvan fokusa i poboljšava vidljivost označenih struktura i njihovu dinamiku u debelim regijama. FSM-ovi se implementiraju označavanjem samo dijela cijele strukture od interesa. U tom smislu, FSM je sličan izvođenju FCS-a na cijelom vidnom polju, iako više stavlja naglasak na prostorne obrasce nego na kvantitativnu vremensku analizu. Fluorescentna točkasta mikroskopija posebno je korisna u određivanju pokretljivosti i agregacije citoskeletnih elemenata kao što su aktin i mikrotubule u hiperaktivnim stanicama.
Mikroskopija smanjene stimulirane emisije (STED) nova je tehnika super-razlučivosti s prostornom razlučivošću daleko iznad granice difrakcije, koja koristi osiromašeno svjetlo u obliku prstena da okruži manji snop pobudnog svjetla kako bi se dobilo pod-50 nm na osi rezolucija. Tehnika se oslanja na pobuđivanje fluorofora sinkroniziranim laserskim impulsima i prostorno koordiniranim kružnim STED impulsima koji iscrpljuju emitirano svjetlo, potiskujući fluorescenciju pobuđenih molekula oko žarišta laserskog skeniranja. Fluorescencija koja se stvara na periferiji mrlje je potisnuta, ali ne i u središtu mrlje, čime se značajno smanjuje veličina fluorescentne mrlje i odgovarajuće značajno povećava razlučivost. STED se pokazao korisnim alatom za detekciju živih stanica visoke razlučivosti. Ostale tehnike super-rezolucije u nastajanju, kao što je fotoaktivirana lokalizacijska mikroskopija (PALM) i mikroskopija sa strukturiranim svjetlosnim osvjetljenjem (SIM), također će postati temeljni alati za snimanje živih stanica u bliskoj budućnosti.
Sve veća upotreba genetski kodiranih fluorescentnih proteina i naprednih sintetičkih fluorofora za oslikavanje živih stanica otvara vrata novim optičkim modalitetima za praćenje vremenske dinamike i prostornih odnosa. Mikroskopisti sada imaju potpuni skup alata za promatranje i snimanje slikovnih podataka o staničnim procesima koji se odvijaju u širokom rasponu vremenskih skala i u više rezolucija. Sporije događaje moguće je lako promatrati i zabilježiti korištenjem laserske skenirajuće konfokalne mikroskopije, dok se brži kinetički događaji mogu dobiti korištenjem tehnologije rotirajućeg diska. Osim toga, multifotonska mikroskopija omogućuje duboko snimanje u debelim tkivima, a tehnike potpune unutarnje refleksije omogućuju ispitivanje površina membrane s konfokalnom preciznošću. Napredne metode fluorescencije, kao što su FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM i STED, mogu se koristiti za praćenje interakcija protein-protein pri rezolucijama koje su često bolje od onih koje dopušta granica difrakcije. S napretkom u tehnologiji fluorofora, mikroskopa i detektora, širi svijet bit će stavljen "pod mikroskop".
