Klasifikacija mikroskopa i princip rada za istraživanje stanica
Mikroskop je primarni alat za promatranje stanica. Prema različitim izvorima svjetlosti, može se podijeliti u dvije kategorije: optički mikroskopi i elektronski mikroskopi. Prvi koristi vidljivu svjetlost (UV mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo) kao izvor svjetlosti, dok drugi koristi zrake elektrona kao izvor svjetlosti.
-,Optički mikroskop
(1) Obični optički mikroskop
Obični biološki mikroskopi sastoje se od tri dijela, naime: ① sustav osvjetljenja, uključujući izvor svjetlosti i kondenzator; ② sustav optičkog povećanja, sastavljen od objektiva i okulara, koji je glavno tijelo mikroskopa. Kako bi se uklonile sferne i kromatske aberacije, i okular i objektiv ③Mehanički uređaj koji se koristi za fiksiranje materijala i olakšavanje promatranja (slika 2-1).
Je li slika mikroskopa jasna ne određuje samo povećanje, već je povezano i s rezolucijom mikroskopa. Rezolucija se odnosi na sposobnost mikroskopa (ili ljudskog oka da bude udaljeno 25 cm od cilja) da razlikuje najmanju udaljenost između objekata. Veličina razlučivosti određena je omjerom valne duljine i otvora svjetlosti te indeksom loma medija izraženi formulom:
U formuli: n=indeks loma medija;=kut otvora blende (kut otvaranja uzorka prema otvoru leće objektiva), NA=otvor blende (numerički otvor blende). Kut leće uvijek je manji od 180 stupnjeva, tako da maksimalna vrijednost sina/2 mora biti manja od 1.
Indeks loma stakla koje se koristi za izradu optičke leće je 1,65 do 1,78, a indeks loma medija koji se koristi što je bliži staklu, to je bolji. Za leće suhih objektiva medij je zrak, a omjer otvora blende leće općenito je 0.05 do 0,95; za uljne leće kao medij se koristi cedrovo ulje, a omjer otvora blende može biti blizu 1,5.
Valna duljina obične svjetlosti je {{0}}nm, tako da vrijednost razlučivosti mikroskopa neće biti manja od 0.2μm, a razlučivost ljudskog oka je 0.2mm, tako da maksimalno povećanje općeg dizajna mikroskopa obično je 1000X.
(2) Fluorescentna mikroskopija
Neke tvari u stanicama, poput klorofila, mogu fluorescirati nakon što su ozračene ultraljubičastim zrakama; neke tvari same ne mogu fluorescirati, ali ako su obojene fluorescentnim bojama ili fluorescentnim antitijelima, mogu fluorescirati i kada su ozračene ultraljubičastim zrakama, a fluorescentni mikroskop (sl. 2-2, 3, 4) jedan je od alata za kvalitativna i kvantitativna istraživanja takvih tvari.
Fluorescentni mikroskopi i obični mikroskopi imaju sljedeće razlike:
1. Metoda osvjetljavanja obično je epi-iluminacija, odnosno izvor svjetlosti projicira se na uzorak kroz leću objektiva (slika 2-3);
2. Izvor svjetlosti je ultraljubičasto svjetlo, valna duljina je kraća, a rezolucija veća od običnih mikroskopa;
3. Postoje dva posebna filtra, onaj ispred izvora svjetlosti koristi se za filtriranje vidljive svjetlosti, a onaj između okulara i leće objektiva koristi se za filtriranje ultraljubičastog svjetla radi zaštite očiju.
(3) Laserski skenirajući konfokalni mikroskop
Laserski konfokalni skenirajući mikroskop (laserski konfokalni skenirajući mikroskop, slika 2-5, 6) koristi laser kao izvor svjetlosti za skeniranje i skenira sliku točku po točku, liniju po liniju, površinu po površinu, a laser za skeniranje i zbirka fluorescencije dijele leća objektiva, a fokus leće objektiva je Žarišna točka lasera za skeniranje također je točka objekta trenutne slike. Budući da je valna duljina laserske zrake kratka, a zraka vrlo tanka, konfokalni laserski skenirajući mikroskop ima veću rezoluciju, koja je oko 3 puta veća od običnog optičkog mikroskopa. Sustav se fokusira jednom i skeniranje je ograničeno na jednu ravninu uzorka. Kada je dubina fokusiranja različita, mogu se dobiti slike različitih razina dubine uzorka. Ove informacije o slici pohranjene su u računalu. Računalnom analizom i simulacijom može se prikazati trodimenzionalna struktura uzorka stanice.
Konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija može se koristiti ne samo za promatranje stanične morfologije, već i za kvantitativnu analizu unutarstaničnih biokemijskih komponenti, statistiku optičke gustoće i mjerenje stanične morfologije.
(4) Mikroskop tamnog polja
Mikroskop s tamnim poljem (mikroskop s tamnim poljem, slika 2-7) ima svjetlosni sloj u središtu kondenzora, tako da svjetlo za osvjetljavanje ne ulazi izravno u ljudsku leću, već samo svjetlo koje se reflektira i difragira na uzorku smije ući u leću objektiva, tako da je pozadina vidnog polja crna, rubovi predmeta su svijetli. Pomoću ovog mikroskopa mogu se vidjeti čestice male od 4-200nm, a razlučivost može biti 50 puta veća od one kod običnih mikroskopa.
(5) Mikroskop faznog kontrasta
Faznokontrastni mikroskop (faznokontrastni mikroskop, slika 2-8, 9) P. Zernikea izumio je 1932. i za njega je 1953. dobio Nobelovu nagradu za fiziku. Najveća značajka ovog mikroskopa je da može promatrati neobojene uzorke i žive stanice.
Osnovno načelo fazno kontrastne mikroskopije je promijeniti optičku razliku putanje vidljive svjetlosti koja prolazi kroz uzorak u razliku amplitude, čime se poboljšava kontrast između različitih struktura i čine različite strukture jasno vidljivima. Nakon prolaska kroz uzorak, svjetlost se lomi, skreće s izvorne optičke putanje i kasni za 1/4λ (valna duljina). Pojačajte, povećajte ili smanjite amplitudu, povećajte kontrast. Što se tiče strukture, mikroskopi s faznim kontrastom imaju dvije posebne značajke koje se razlikuju od običnih optičkih mikroskopa:
1. Prstenasta dijafragma nalazi se između izvora svjetlosti i kondenzora, a njezina je funkcija učiniti da svjetlost koja prolazi kroz kondenzor oblikuje šuplji svjetlosni stožac i fokusira se na uzorak.
2. Fazna ploča (prstenasta fazna ploča) dodaje faznu ploču presvučenu magnezijevim fluoridom u leću objektiva, što može odgoditi fazu izravne svjetlosti ili difraktirane svjetlosti za 1/4λ. Postoje dvije vrste:
①A plus fazna ploča: Izravna svjetlost kasni za 1/4λ. Nakon što se spoje dvije skupine svjetlosnih valova, svjetlosni valovi se zbrajaju i amplituda se povećava. Struktura uzorka je svjetlija od okolnog medija, stvarajući svijetli kontrast (ili negativni kontrast).
② B plus fazna ploča: difraktirana svjetlost kasni za 1/4λ. Nakon što se dva skupa zraka spoje, svjetlosni valovi se oduzimaju, a amplituda postaje manja, stvarajući tamni kontrast (ili pozitivni kontrast), a struktura je tamnija od okolnog medija.
(6) Polarizacijski mikroskop
Polarizacijski mikroskop koristi se za otkrivanje tvari s dvolomnošću, kao što su niti, vretena, kolagen, kromosomi i tako dalje. Razlika od običnih mikroskopa je u tome što se ispred izvora svjetlosti nalazi polarizator (polarizator), tako da svjetlost koja ulazi u mikroskop je polarizirana svjetlost, a postoji analizator (polarizator čiji je smjer polarizacije okomit na polarizator) u cijevi objektiva. Stalak ovog mikroskopa može se rotirati. Kada se jednostruka lomna tvar postavi na postolje, bez obzira na to kako se postolje okreće, budući da su dva polarizatora okomita, u mikroskopu se ne vidi svjetlost, a svjetlost nije vidljiva u mikroskopu. Prilikom ulaska u dvolomne materijale, rotirajući stupanj može otkriti takve objekte jer se svjetlost skreće dok prolazi kroz takve materijale.
