Optička svojstva bioloških mikroskopa
Optička izvedba mikroskopa određena je sljedećih osam osnovnih optičkih parametara (ili parametara):
(1) Numerička apertura
Numerička apertura se također naziva omjer zrcala. Odnosi se na umnožak indeksa loma n medija između promatranog objekta i leće i vrijednosti sinusa polovice kuta leće objektiva. Koristite NA ili A. za predstavljanje. NA{0}}nsin( /2)
Takozvani kut otvora zrcala odnosi se na kut između rubnih zraka promatrane točke koje ulaze u prednju leću leće objektiva.
Numerička apertura važan je parametar leće objektiva i sabirne leće te je usko povezana s ostalim optičkim parametrima mikroskopa. Općenito se nada da što je veći to bolji. Iz formule je vidljivo da postoje dva načina za povećanje numeričke aperture, jedan je povećanje kuta ušća zrcala, a drugi je povećanje indeksa loma između leće objektiva i uzorka.
Kada se usvoji prva metoda, uzorak i predmet mogu se držati što je moguće bliže. Ali bez obzira koliko blizu, uvijek je manje od 180 stupnjeva. Dakle, sin( /2) je također manji od 1. Indeks loma zraka je n=1. Stoga je numerička apertura nsin(/2) leće suhog objektiva uvijek manja od 1, općenito između 0.04 i 0.95.
Kada se usvoji potonja metoda, između leće objektiva i uzorka može se dodati medij s višim indeksom loma. Na primjer, indeks loma cedrovog ulja je n=1,515. Kada se kao medij koristi cedrovo ulje, numerička apertura može doseći više od 1,2. Zato se u nekim slučajevima koriste uljne naočale. Trenutačno je maksimalni numerički otvor blende koji uljana leća može postići 1,4.
(2) Razlučivost
Razlučivost se također naziva stopa diskriminacije ili moć razlučivosti. Takozvana rezolucija odnosi se na sposobnost mikroskopa da razlikuje finu strukturu predmeta koji se pregledava. Obrnuto je proporcionalna udaljenosti rezolucije. Udaljenost rezolucije odnosi se na minimalnu udaljenost između dvije točke objekta koje se mogu razlikovati. Što je udaljenost razlučivanja manja, to je veća razlučivost mikroskopa. Ako je udaljenost između dviju točaka objekta manja od udaljenosti razlučivosti, dvije će se točke zamijeniti za jednu točku, a njezina se struktura ne može jasno vidjeti. Razlučivost mikroskopa određena je lećom objektiva. Okulari samo povećavaju, a ne povećavaju rezoluciju mikroskopa.
U slučaju normalnog središnjeg osvjetljenja, udaljenost razlučivanja d leće objektiva određena je sljedećom formulom.
d=(λ/2)N.A.
U formuli: d predstavlja udaljenost rezolucije, jedinica je mikron, λ predstavlja valnu duljinu svjetlosti osvjetljenja, jedinica je također mikron.
U vidljivom svjetlu, valna duljina s najvećom svjetlinom i najvećom osjetljivošću za ljudske oči je {{0}},55 μm, a maksimalna NA leće objektiva je 1,4. Zamjenom u gornju formulu, d je približno 0.2 μm. To jest, s običnim optičkim mikroskopom, granica udaljenosti rezolucije je 0.2 μm u slučaju središnjeg osvjetljenja. Naime, obični optički mikroskopi ne mogu razlikovati dva objekta manja od 0,2 μm.
Korištenjem ultraljubičastog svjetla, valna duljina svjetlosti osvjetljenja može se smanjiti, omogućujući da udaljenost rezolucije dosegne 0,1 μm. Ali ultraljubičaste zrake ljudsko oko ne može vidjeti. Može se vidjeti samo nakon snimanja slike.
Valna duljina protoka elektrona je samo 0.00387nm. Korištenjem "elektronske leće" ili magnetske leće za kontrolu protoka elektrona, udaljenost razlučivosti elektronskog mikroskopa je do nekoliko desetinki nanometra. Može se koristiti za promatranje strukture atoma.
(3) Povećanje
Povećanje mikroskopa jednako je umnošku povećanja leće objektiva i povećanja okulara. U principu, povećanje može biti vrlo veliko. Međutim, ako se detalji uzorka ne mogu razlučiti lećom objektiva, bez obzira na to koliko je veliko povećanje, ono je besmisleno. Teoretski, može se zaključiti da je najprikladnije povećanje mikroskopa (zvano efektivno povećanje, predstavljeno efektivnim M) između 500 i 1000 puta većeg numeričkog otvora leće objektiva. Odnosno 500N.A. Manje od ili jednako M efektivno Manje od ili jednako 1000N.A.
Unutar učinkovitog raspona povećanja, oči mogu promatrati dugo vremena bez zamora. Ako je povećanje manje od 500 NA, bit će teško promatrati. Ako je veći od 1000N.A., to će pogoršati kvalitetu slike i čak uzrokovati nestvarnu sliku. Stoga je povećanje preko 1000N.A. naziva se nevažećim povećanjem.
(4) Radna udaljenost
Radna udaljenost odnosi se na udaljenost između donje površine leće objektiva i gornje površine pokrovnog stakla nakon što je mikroskop fokusiran, koristeći standardno pokrovno staklo i standardnu duljinu mehaničke cijevi. Što je veće povećanje leće objektiva, to je kraća radna udaljenost. Općenito, radna udaljenost objektiva male snage ispod 10 puta iznosi 5-7mm, dok je radna udaljenost 100 puta uljne leće samo oko 0,19 mm.
(5) Dubina fokusa
Kad se mikroskop fokusira na određenu ravninu u preparatu, ne samo da se može jasno vidjeti predmetna ravnina, nego se istovremeno mogu jasno vidjeti i gornja i donja objektna ravnina koje su s njom povezane. Udaljenost između gornje i donje ravnine objekta naziva se dubina fokusa ili skraćeno dubina fokusa.
Dubina fokusa mikroskopa je vrlo mala, a što je brojčani otvor veći, to je ukupno povećanje veće, a dubina fokusa manja. Na primjer, kada za promatranje koristite uljnu leću s NA od 1,25/100 puta i okular 12,5 puta, dubina fokusa je samo 0,27 μm. To znači da se nakon fokusiranja može jasno vidjeti samo tanki sloj debljine 0,27 μm. Obični uzorci obično su debeli nekoliko mikrona. Da biste vidjeli cijeli preparat, potrebno je koristiti mehanizam finog podešavanja mikroskopa za promatranje u slojevima od vrha do dna.
(6) vidno polje
Vidno polje se još naziva i vidno polje. Odnosi se na opseg predmeta koji se pregledava koji mikroskop može vidjeti u jednom trenutku. Obično želimo da vidno polje bude što veće. Vidno polje mikroskopa određeno je vidnim poljem leće objektiva i vidnim poljem okulara. Vidno polje obične leće objektiva manje je od 20 mm, a velike može doseći i više od 40 mm. Vidno polje običnih 10x okulara je 14 mm, a kod velikih može doseći i više od 24 mm. Nakon što su objektiv i okular dizajnirani, njihovo vidno polje je fiksno. Budući da je vidno polje običnog mikroskopa malo, nemoguće je vidjeti cijeli preparat u jednom vidnom polju, može se vidjeti samo vrlo mali krug na preparatu. Štoviše, veličina vidnog polja obrnuto je proporcionalna ukupnom povećanju mikroskopa. Što je veće ukupno povećanje, to je manje vidno polje. Rješenje je koristiti pokretač kako bi svaki dio uzorka redom ulazio u vidno polje i redom promatrao.
(7) Svjetlina zrcala
Svjetlina zrcala odnosi se na svjetlinu i tamnost slike objekta koja se vidi u mikroskopu. Kako bismo olakšali promatranje, nadamo se da je rezultirajuća slika svjetlija. U slučaju stalne vanjske svjetlosti, svjetlina zrcala proporcionalna je kvadratu numeričke aperture i obrnuto proporcionalna kvadratu ukupnog povećanja. Kako bi slika bila svjetlija, potrebno je koristiti leću objektiva s velikim numeričkim otvorom blende s okularom s malim povećanjem. Na primjer, u slučaju iste leće objektiva, korištenje 5X okulara će proizvesti zrcalnu sliku koja je 4 puta svjetlija nego korištenje 10X okulara.
Za mikroskope koji koriste električne izvore svjetlosti, svjetlinom zrcalne slike može se upravljati podešavanjem svjetline iluminatora.
(8) Jasnoća
Jasnoća mikroskopske slike ovisi o njegovom optičkom sustavu, posebno o optičkim performansama leće objektiva. Povezan je s dizajnom, proizvodnjom, uporabom i skladištenjem mikroskopa. To je važno i složeno pitanje. Iz perspektive korištenja i skladištenja, glavni razlozi koji utječu na jasnoću su: debljina upotrijebljenog pokrovnog stakla je nekvalificirana, fokus nije podešen na idealan položaj, ukupno povećanje je preveliko i leća ulja leća nije obrisana. Očistiti, plijesan na lećama itd.
