Princip i primjena fluorescentne mikroskopije
(1) Princip i strukturne karakteristike fluorescentnog mikroskopa: fluorescentni mikroskop koristi točkasti izvor svjetlosti s visokom svjetlosnom učinkovitošću za emitiranje svjetlosti određene valne duljine (kao što je ultraljubičasto svjetlo 3650 in ili ljubičasto plavo svjetlo 4200 in) kroz sustav filtera kao pobudna svjetlost za pobuđivanje uzorka. Nakon što fluorescentna tvar iznutra emitira fluorescenciju različitih boja, promatra se kroz povećanje objektiva i okulara. Na taj način, pod jakom kontrastnom pozadinom, čak i ako je fluorescencija vrlo slaba, lako se identificira i ima visoku osjetljivost. Uglavnom se koristi za istraživanje stanične strukture i funkcije te kemijskog sastava. Osnovna struktura fluorescentnog mikroskopa sastoji se od običnog optičkog mikroskopa plus nekih dodataka (kao što je fluorescentni izvor svjetlosti, pobudni filtar, dvobojni razdjelnik snopa i blokirajući filtar, itd.). Fluorescentni izvor svjetlosti - općenito koristite živinu žarulju ultravisokog tlaka (50-200W), koja može emitirati svjetlost različitih valnih duljina, ali svaka fluorescentna tvar ima valnu duljinu pobude koja proizvodi najjaču fluorescenciju, pa je potrebno dodati pobudni filtar (općenito, postoje ultraljubičasti, ljubičasti, plavi i zeleni pobudni filtri), koji dopuštaju samo pobudnom svjetlu određene valne duljine da prođe i ozrači uzorak, dok apsorbira drugo svjetlo. Nakon što je svaka tvar ozračena pobudnim svjetlom, emitira vidljivu fluorescenciju s dužom valnom duljinom od valne duljine ozračivanja u vrlo kratkom vremenu. Fluorescencija je specifična i općenito slabija od ekscitacijske svjetlosti. Za promatranje specifične fluorescencije potreban je blokirajući (ili suzbijajući) filtar iza leće objektiva. Ima dvije funkcije: jedna je apsorbirati i blokirati ulazak pobudne svjetlosti u okular, kako ne bi poremetila fluorescenciju i oštetila oči; drugi je odabrati i pustiti određenu fluorescenciju da prođe, pokazujući određenu fluorescentnu boju. Dva filtra moraju se koristiti zajedno.
Postoje dvije vrste fluorescentnih mikroskopa u smislu njihovih optičkih putanja:
1. Transmisijski fluorescentni mikroskop: Ekscitacijski izvor svjetlosti pobuđuje fluorescenciju kroz materijal uzorka kroz kondenzorsku leću. Obično se koristi kolektor tamnog polja, a obični kolektor također se može koristiti za podešavanje zrcala tako da se pobudna svjetlost prenosi i zaobilazi na uzorak. Ovo je staromodni fluorescentni mikroskop. Prednost je što je fluorescencija jaka pri malom povećanju, a nedostatak je što fluorescencija opada s povećanjem povećanja. Stoga je bolji za promatranje materijala većih uzoraka.
2. Epi-fluorescentni mikroskop Ovo je nova vrsta fluorescentnog mikroskopa razvijena u moderno doba. Razlika je u tome što pobudna svjetlost pada s leće objektiva na površinu preparata, odnosno koristi se ista leća objektiva kao kondenzor osvjetljenja i leća objektiva za prikupljanje fluorescencije. Dihroični razdjelnik snopa treba dodati na put svjetlosti, koji je 45 stupnjeva udaljen od svjetlosnog urana. Pobuđeno svjetlo se reflektira u leću objektiva i skuplja na uzorku. Fluorescencija koju stvara uzorak i pobudna svjetlost koju reflektira površina leće objektiva i površina pokrovnog stakla ulaze u leću objektiva u isto vrijeme i vraćaju se u dvobojni razdjelnik snopa kako bi se pobudna svjetlost odvojila od fluorescencije , preostalo pobudno svjetlo apsorbiraju blokirajući filtri. Ako prijeđete na kombinaciju različitih pobudnih filtara/dvobojnih razdjelnika snopa/blokirajućih filtara, mogu se zadovoljiti potrebe za različitim produktima fluorescentne reakcije. Prednost ovakvog fluorescentnog mikroskopa je što je osvjetljenje vidnog polja ravnomjerno, slika je jasna, a što je veće povećanje, to je fluorescencija jača.
(2) Kako koristiti fluorescentni mikroskop.
1. Uključite izvor svjetla, živina žarulja ultravisokog pritiska treba se zagrijati nekoliko minuta kako bi dosegla najsvjetliju točku.
2. Za transmisioni fluorescentni mikroskop, potreban pobudni filtar treba biti instaliran između izvora svjetlosti i kondenzatora, a odgovarajući blokirajući filtar treba biti instaliran iza leće objektiva. Epi-fluorescentni mikroskopi moraju u utore na putu svjetlosti umetnuti potrebni filtar za pobudu/razdjelnik dvobojnog snopa/blokirajući filtar.
3. Promatrajte lećom s malim povećanjem i namjestite središte izvora svjetlosti prema uređaju za podešavanje različitih tipova fluorescentnih mikroskopa tako da se nalazi u središtu cijele točke osvjetljenja.
4. Postavite list s uzorkom i promatrajte nakon fokusiranja. Treba obratiti pozornost tijekom uporabe: Ne promatrajte izravno krajnjim filtrom kako ne biste oštetili oči; pri promatranju preparata uljnom lećom potrebno je koristiti posebnu uljnu leću bez fluorescencije; nakon što se visokotlačna živina žarulja isključi, ne može se odmah ponovno upaliti, te ju je potrebno ispitati. Može se ponovno pokrenuti nakon 5 minuta, inače će biti nestabilna i utjecati na vijek trajanja živine žarulje.
(3) Opažanje Koristeći plavo-ljubičasti svjetlosni filtar pod fluorescentnim mikroskopom na platformi za učenje, može se vidjeti da su stanice obojene s 0,01 posto akridin narančaste fluorescentne boje, jezgra i citoplazma pobuđeni da proizvode dvije različite boje fluorescencija (tamno) zelena i narančasto-crvena).
