Princip i konstrukcija fluorescentnog mikroskopa
Fluorescentni mikroskop koristi točkasti izvor svjetlosti visoke svjetlosne učinkovitosti, koji emitira određenu valnu duljinu svjetlosti (kao što je ultraljubičasto svjetlo 3650 in ili ljubičasto plavo svjetlo 4200 in) kroz sustav filtriranja boja kao pobudno svjetlo, i pobuđuje fluorescentne tvari u uzorku na emitiraju različite boje fluorescencije. Nakon toga se promatra povećanjem objektiva i okulara. Na taj način, čak i sa slabom fluorescencijom, lako je prepoznatljiv i vrlo osjetljiv pod jakim kontrastnim pozadinama, uglavnom se koristi za proučavanje stanične strukture i funkcije, kao i kemijskog sastava. Osnovna struktura fluorescentnog mikroskopa sastoji se od običnog optičkog mikroskopa i nekih dodataka (kao što je fluorescentni izvor svjetlosti, pobudni filtar, bikromatski separator snopa i blokirajući filtar itd.). Fluorescentni izvori svjetlosti - obično koriste živine žarulje ultravisokog tlaka (50-200W), koje mogu emitirati svjetlost različitih valnih duljina. Međutim, svaka fluorescentna tvar ima valnu duljinu pobudne svjetlosti koja proizvodi najjaču fluorescenciju, pa je potrebno dodati pobudne filtre (obično ultraljubičaste, ljubičaste, plave i zelene pobudne filtre) kako bi se dopustilo da samo određena valna duljina pobudne svjetlosti prođe i osvijetli uzorak, dok apsorbira svu ostalu svjetlost. Nakon zračenja pobuđenom svjetlošću, svaka tvar emitira vidljivu fluorescenciju s dužom valnom duljinom od zračenja u vrlo kratkom vremenskom razdoblju. Fluorescencija je specifična i općenito je slabija od ekscitacijske svjetlosti. Kako bi se promatrala specifična fluorescencija, potrebno je dodati filter za blokiranje (ili suzbijanje) iza leće objektiva. Ima dvije funkcije: prvo, apsorbira i blokira pobudno svjetlo da uđe u okular kako bi se izbjeglo ometanje fluorescencije i oštećenje očiju; drugo, odabire i dopušta da određena fluorescencija prođe, prikazujući određenu boju fluorescencije. Obje vrste filtara moraju biti odabrane za korištenje zajedno.
Postoje dvije vrste fluorescentnih mikroskopa na temelju njihovog optičkog puta:
1. Transmisijski fluorescentni mikroskop: Ekscitacijski izvor svjetlosti prenosi se kroz materijal uzorka kroz kondenzator za pobuđivanje fluorescencije. Uobičajeno korišteni kolektori svjetla tamnog polja ili obični kolektori svjetla mogu se koristiti za podešavanje reflektora za pretvaranje pobudnog svjetla i bočnog svjetla na uzorak. Ovo je relativno staromodan fluorescentni mikroskop. Prednost mu je što je fluorescencija jaka pri malom povećanju, a nedostatak što fluorescencija slabi s povećanjem. Stoga je bolji za promatranje materijala većih uzoraka.
2. Fluorescencijski mikroskop s padajućim snopom Ovo je nova vrsta fluorescentnog mikroskopa razvijena u moderno doba. Za razliku od prethodnog, pobudna svjetlost pada s leće objektiva na površinu uzorka, koristeći istu leću objektiva kao iluminacijski kondenzor i leću objektiva za prikupljanje fluorescencije. Dvobojni separator zraka treba dodati optičkoj stazi, koja je pod kutom od 45 stupnjeva u odnosu na svjetlosni uran. Pobuđeno svjetlo se reflektira u leću objektiva i koncentrira na uzorak. Fluorescencija koju stvara uzorak, kao i ekscitacijsko svjetlo reflektirano od površine leće objektiva i pokrovnog stakla, istovremeno ulaze u leću objektiva i vraćaju se u dikroični separator snopa, odvajajući ekscitaciju i fluorescenciju. Zaostalu pobudu tada apsorbira blokirajući filtar. Ako se koriste različiti filtri za pobudu/dvobojni separatori snopa/kombinacije filtara za blokiranje, oni mogu zadovoljiti potrebe za različitim produktima fluorescentne reakcije. Prednost ovog fluorescentnog mikroskopa je što je osvjetljenje vidnog polja ravnomjerno, slika je jasna, a što je veće povećanje, fluorescencija je jača.
