Principi konfokalne mikroskopije
Konfokalni mikroskop je visokoprecizan instrument za snimanje koji se pojavio i razvio 1980-ih, te je ključni instrument znanstvenog istraživanja za proučavanje submikronskih struktura. S razvojem računala, softvera za obradu slike i lasera, veliki razvoj su doživjeli i konfokalni mikroskopi, koji se danas široko koriste u područjima biologije, mikrosustava i mjerenja materijala. Konfokalni mikroskop je nova vrsta mikroskopa koji integrira konfokalni princip, tehnologiju skeniranja i tehnologiju obrade računalne grafike. Njegove glavne prednosti su: visoka bočna razlučivost i visoka aksijalna razlučivost, te učinkovito potiskivanje raspršenog svjetla, s visokim kontrastom.
Tipična postavka konfokalnog mikroskopa je postavljanje dvije male rupe na konjugiranoj ravnini žarišne ravnine mjerenog objekta, od kojih je jedna postavljena ispred izvora svjetlosti, a druga ispred detektora, kao što je prikazano na slici 1. Na slici se može vidjeti da kada je izmjereni uzorak u kvazifokusnoj ravnini, intenzitet svjetlosti prikupljen detekcijskim krajem je najveći; kada je mjereni uzorak u položaju izvan fokusa, svjetlosna točka na kraju detekcije difuzira i intenzitet svjetlosti se brzo smanjuje. Dakle, samo svjetlost koju emitiraju točke na žarišnoj ravnini može proći kroz izlaznu rupicu, dok je svjetlost koju emitiraju točke izvan žarišne ravnine defokusirana na izlaznoj ravnini rupice i većina njih ne može proći kroz središnju rupicu. Zbog toga se ciljna točka promatranja na žarišnoj ravnini čini svijetlom, a točka koja nije promatranje izgleda crna kao pozadina, čime se povećava kontrast i čisti slika. Tijekom procesa snimanja, dvije rupice su konfokalne, konfokalna točka je detektirana točka, a ravnina u kojoj se detektirana točka nalazi je konfokalna ravnina.
Veličina rupice na detektoru u konfokalnoj mikroskopiji igra ključnu ulogu. To izravno utječe na razlučivost i omjer signala i šuma sustava. Ako je rupica prevelika, neće se postići konfokalni učinak detekcije, što ne samo da smanjuje rezoluciju sustava, već također uvodi više rasutog svjetla; ako je rupica premala, to će smanjiti učinkovitost detekcije i smanjiti mikroskopsku sliku. svjetlina. Studije su pokazale da kada je promjer rupice jednak promjeru Airy diska, konfokalni zahtjevi su zadovoljeni, a učinkovitost detekcije nije značajno smanjena. Budući da je promjer rupice općenito veličine mikrona, ako postoji odstupanje između fokusne točke laserske zrake i položaja rupice, doći će do izobličenja signala. Stoga konfokalni mikroskopi općenito koriste sustav autofokusa, koji praktički povećava vrijeme mjerenja.
Budući da je laserski konfokalni skenirajući mikroskop točkasto snimanje, za dobivanje dvodimenzionalne slike objekta potrebno je koristiti dvodimenzionalno skeniranje u x i y smjerovima. Različiti mikroskopi koriste različite metode skeniranja:
(1) Skeniranje objekta. To jest, sam objekt se kreće prema određenom zakonu, dok svjetlosni snop ostaje nepromijenjen. Prednosti: stabilan optički put; Nedostaci: potreban je veliki stol za skeniranje, pa je brzina skeniranja uvelike ograničena.
(2) Sustav za skeniranje snopa formira se pomoću reflektivnog galvanometra. To jest, kontroliranjem skenirajućeg galvanometra, fokusirana svjetlosna točka redovito se reflektira na određeni sloj objekta kako bi se dovršilo dvodimenzionalno skeniranje. Njegova prednost je što ima visoku preciznost i često se koristi za mjerenje visoke preciznosti. Brzina skeniranja poboljšana je u odnosu na skeniranje objekata, ali još uvijek nije brza.
(3) Koristite akusto-optički otklonski element za skeniranje, a skeniranje se ostvaruje promjenom izlazne frekvencije zvučnog vala i zatim promjenom smjera prijenosa svjetlosnog vala. Njegova izuzetna prednost je što je brzina skeniranja vrlo velika. Sustav skeniranja koji su razvile Sjedinjene Države koristi akusto-optički deflektor za generiranje video slika u stvarnom vremenu. Za skeniranje dvodimenzionalne slike potrebna je samo 1/30 s i gotovo se postiže ispis u stvarnom vremenu.
(4) Nipkow skeniranje diska. Proces skeniranja dovršava se rotiranjem Nipkow diska dok ostale komponente ostaju mirne. Može se slikati odjednom i brzina je vrlo velika. Međutim, budući da je snop slike izvan osi svjetlosti, izvanosna aberacija leće mora se ispraviti, a stopa iskorištenja svjetlosne energije je vrlo niska.
