Principi fluorescentne mikroskopije
Fluorescentni mikroskopi razlikuju se od običnih optičkih mikroskopa. Umjesto promatranja uzoraka pod osvjetljenjem uobičajenih izvora svjetlosti, oni koriste svjetlost određene valne duljine (obično ultraljubičasto svjetlo, plavo-ljubičasto svjetlo) kako bi pobudili fluorescentne tvari u uzorcima pod mikroskopom kako bi oni emitirali fluorescenciju. Stoga izvor svjetlosti fluorescentnog mikroskopa ne funkcionira kao izravno osvjetljenje, već kao izvor energije koji pobuđuje fluorescentne tvari unutar uzorka. Razlog zašto možemo promatrati uzorak je zbog osvjetljenja izvora svjetlosti, ali fenomen fluorescencije koji se pojavljuje nakon što fluorescentna tvar u uzorku apsorbira pobuđenu svjetlosnu energiju.
Vidljivo je da je karakteristika fluorescentnog mikroskopa da njegov izvor svjetlosti može dati veliku količinu pobudne svjetlosti u određenom području valne duljine, tako da fluorescentna tvar u ispitivanom uzorku može dobiti pobudnu svjetlost potrebnog intenziteta. Istovremeno, fluorescentni mikroskop mora imati odgovarajući sustav filtera.
Fluorescentna mikroskopija je bitan alat u imunofluorescentnoj histokemiji. Sastoji se od izvora ultravisokog napona svjetlosti, sustava filtara (uključujući filtarsku ploču za pobudu i suzbijanje), optičkog sustava i fotografskog sustava te drugih glavnih komponenti. Koristi svjetlost određene valne duljine da potakne uzorak da emitira fluorescenciju.
Način pobuđivanja fluorescencije: Prema rasponu valnih duljina svjetlosti, može se podijeliti u dvije vrste: UV pobudna metoda (pomoću ultraljubičaste metode) i BV pobudna metoda (pomoću plavo-ljubičastog svjetla). Metoda UV ekscitacije za ekscitaciju koristi skoro ultraljubičasto svjetlo kraće od 400 nm. U ovoj metodi nema vidljive ekscitacijske svjetlosti, tako da opažena fluorescencija predstavlja svojstvenu fluorescenciju boje i lako je razlikovati specifičnu fluorescenciju na uzorku od autofluorescencije pozadinskog tkiva.
BV metoda ekscitacije temelji se na 404 nm i 434 nm za ekscitaciju od ultraljubičastog do plavog svjetla. Ova metoda koristi plavo svjetlo za ozračivanje uzorka, tako da filtar za isključivanje fluorescencijskog sustava za promatranje mora koristiti filtar koji može potpuno blokirati plavo svjetlo i u potpunosti propustiti potrebnu zelenu i žutu fluorescenciju. Fluorescentne boje za analizu fluorescentnih antitijela. Maksimalna valna duljina apsorpcije pobudnog svjetla relativno je blizu maksimalne valne duljine emisije fluorescencije, tako da filtar koji se koristi u BV metodi pobude mora koristiti oštar filtar za odsječenje. Ova metoda može koristiti plavo svjetlo kao pobudno svjetlo, tako da je učinkovitost apsorpcije fluorescentnog pigmenta veća i može se dobiti svjetlija slika. Njegov nedostatak je što se fluorescencija ispod 500 nm ne može vidjeti, a fluorescencija iznad 500 nm čini da cijela slika izgleda žuto. U metodi fluorescentnih protutijela, specifičnost fluorokroma često se procjenjuje prema boji jedinstvenoj za fluorokrom. Stoga, kada se govori o suptilnoj specifičnosti, gore navedeni nedostaci metode ekscitacije BV često imaju veliki utjecaj.
Ukratko, osvjetljenje fluorescentnog mikroskopa može se razmotriti prema sljedeće tri točke prema strukturi kondenzatora i valnoj duljini pobudnog svjetla.
① Iz perspektive zahtjeva za kontrastom fluorescentne slike, za osvjetljenje se koristi koncentrator tamnog polja uz pobudu UV zraka.
② S obzirom na svjetlinu slike, BV pobudni filtar ima najveću učinkovitost promatranja tamnog polja.
③Karakteristike promatranja tamnog polja s UV pobudnim filtrom i BV pobudnog osvjetljenja koncentratorom tamnog polja mogu se smatrati između ove dvije metode osvjetljenja, ali prva ima jača svojstva tamnog polja i prikazuje svjetlije slike. Kontrast je mali; potonji zadržava svojstva putanje svjetlosti tamnog polja, pa je prikazana slika tamnija, a kontrast je poboljšan. Kada se zapravo koristi fluorescentni mikroskop, za promatranje treba koristiti metodu osvjetljenja koja najbolje odgovara zahtjevima uzorka.
Mora se istaknuti da čak i ako se osvijetli UV-pobuđeni kondenzor tamnog polja s najboljim kontrastom, dio ultraljubičastog pobudnog svjetla lomljenog ili raspršenog na uzorku će ući u leću objektiva. Autofluorescencija može pogoršati odgovor slike. Stoga se filtar koji apsorbira UV zračenje mora koristiti ispred okulara kao filtar za odsječenje.
