Principi laserske konfokalne mikroskopije (LSCM)
Laserski konfokalni mikroskop koristi rupicu za osvjetljavanje postavljenu iza izvora svjetlosti i rupicu za otkrivanje postavljenu ispred detektora za postizanje točkastog osvjetljenja i otkrivanja točka. Svjetlost iz izvora svjetlosti fokusirana je na točku u žarišnoj ravnini uzorka pomoću svjetla emitiranog kroz rupicu za osvjetljavanje, a fluorescencija emitirana iz te točke prikazuje se unutar rupice za otkrivanje, a svako emitirano svjetlo izvan te točke blokirano je rupica za otkrivanje. Rupica za osvjetljavanje i rupica za detekciju su konjugirane za osvijetljenu ili detektiranu točku, tako da je detektirana točka konfokalna točka, a ravnina u kojoj se nalazi detektirana točka je konfokalna ravnina. Računalo prikazuje detektiranu točku na zaslonu računala u obliku slikovne točke. Kako bi se proizvela potpuna slika, sustav za skeniranje u optičkom putu skenira preko žarišne ravnine uzorka, stvarajući tako potpunu konfokalnu sliku. Sve dok se postolje nosača pomiče gore-dolje duž Z-osi, nova razina uzorka pomiče se u konfokalnu ravninu, a nova razina uzorka prikazuje se na monitoru, dok Z-os nastavlja pomaknuti, dobivaju se uzastopne svjetlosno izrezane slike različitih razina uzorka.
Tradicionalni optički mikroskop koristi izvor svjetlosti polja, slika svake točke na uzorku bit će ometena difrakcijom ili raspršenjem svjetlosti od susjednih točaka; laserski skenirajući konfokalni mikroskop koristi lasersku zraku kroz osvijetljenu rupicu za formiranje točkastog izvora svjetlosti na uzorku skeniranom u svakoj točki unutarnje žarišne ravnine, uzorku na ozračenoj točki, prikaz detekcijske rupice, detekcijom rupice nakon svjetlosne multiplikacijske cijevi (PMT) ili hladnog elektrosparenog uređaja (cCCD) Primljeno točku po točku ili liniju po liniju, fluorescentna slika se brzo formira na zaslonu monitora računala. Rupica za osvjetljenje i rupica za otkrivanje u odnosu na žarišnu ravninu leće objektiva je konjugirana, točka na žarišnoj ravnini u isto je vrijeme fokusirana na rupicu za osvjetljenje i rupicu za emisiju, točka izvan žarišne ravnine neće biti u detekciji rupicu na slici, tako da je dobivena konfokalna slika optički presjek uzorka, prevladavajući nedostatke obične nejasne slike mikroskopa.
Iz osnovnog principa, laserski konfokalni mikroskop je moderan optički mikroskop, to je obični svjetlosni mikroskop iz tehnologije za sljedeća poboljšanja.
1. Koristite laser kao izvor svjetlosti jer je monokromatičnost lasera vrlo dobra, valna duljina zrake izvora svjetlosti je ista, u osnovi eliminirajući kromatsku aberaciju.
2. Upotreba konfokalne tehnologije u žarišnoj ravnini leće objektiva postavljenoj u sredini s malom rupom u pregradi, žarišna ravnina izvan blokiranja rasutog svjetla, eliminirajući sferičnu aberaciju; i dodatno eliminirati kromatsku aberaciju.
3. Laserski konfokalni mikroskop koji koristi tehnologiju točkastog skeniranja za rastavljanje uzorka u dvodimenzionalni ili trodimenzionalni prostor u bezbroj točaka, s vrlo malom laserskom zrakom (točkasti izvor svjetlosti) skeniranje slike točku po točku, liniju po liniju, a zatim kroz kombinacija mikroračunala cijele ravnine ili trodimenzionalne slike. Tradicionalni svjetlosni mikroskop je terenski izvor svjetlosti pod jednokratnim snimanjem, uzorci na svakoj točki slike bit će uz točku difraktirane svjetlosti i interferencije raspršene svjetlosti. Jasnoća i preciznost ove dvije slike ne mogu se usporediti.
4. Akvizicija i obrada optičkih signala računalom i pojačanje signala fotomultiplikatorskom cijevi
U laserskom konfokalnom mikroskopu računalo zamjenjuje ljudsko oko ili kameru za promatranje i video snimanje, a dobivene slike se digitaliziraju i mogu se obraditi u računalu kako bi se ponovno poboljšala jasnoća slika. Štoviše, uporaba fotomultiplikatorskih cijevi može pojačati vrlo slabe signale, uvelike poboljšavajući osjetljivost. Kao rezultat kombinirane uporabe gore navedenih tehnologija, može se reći da je LSCM najnapredniji mikroskop na svijetu. Može se reći da je LSCM kombinacija tehnologije proizvodnje mikroskopa, fotoelektrične tehnologije, računalne tehnologije **, neizbježan proizvod razvoja moderne tehnologije.
