Zahtjevi za pripremu uzoraka za fluorescentnu mikroskopiju
Zahtjevi za pripremu uzorka za fluorescentnu mikroskopiju
(1) Staklo
Debljina stakalca treba biti između 0.8-L2 mm. Predebelo predmetno stakalce apsorbirat će više svjetla s jedne strane, a s druge strane ne može fokusirati pobudno svjetlo na uzorak. Stakalca moraju biti glatka, ujednačene debljine i bez očigledne autofluorescencije. Ponekad se koriste kvarcni tobogani.
(2) Pokrovno staklo
Debljina pokrovnog stakla je oko 0,17 mm, glatko. Za pojačavanje pobudnog svjetla može se koristiti i interferencijsko pokrovno staklo, posebno pokrovno staklo presvučeno s nekoliko slojeva tvari (kao što je magnezijev fluorid) koje imaju različite interferencijske učinke na svjetlost različitih valnih duljina, što može učiniti fluorescencija glatka. Pobudno svjetlo prolazi, a pobudno svjetlo se reflektira, a to reflektirano pobudno svjetlo može pobuditi uzorak.
(3) Uzorak
Kriške tkiva ili drugi uzorci ne smiju biti predebeli. Ako je debljina predebela, većina pobudnog svjetla potrošit će se u donjem dijelu uzorka, dok se gornji dio koji izravno promatra leća objektiva ne može u potpunosti pobuditi. Osim toga, fluorescencija uzrokovana preklapanjem stanica ili nečistoća, pozadinsko nespecifično bojenje utječe na prosudbu.
(4) ulje za ogledalo
Općenito, pri promatranju uzoraka fluorescentnim mikroskopima s tamnim poljem i uljnim imerzijskim mikroskopima mora se koristiti imerzijsko ulje. Najbolje je koristiti posebno nefluorescentno ulje za uranjanje. Umjesto njega može se koristiti i glicerin, a može se koristiti i tekući parafin, ali je indeks loma nizak, što malo utječe na kvalitetu slike.
Razumijevanje svjetlosne kocke fluorescentne mikroskopije
Fluorescencija je svjetlost kojom elektroni u tvari apsorbiraju svjetlosnu energiju iz niskoenergetskog stanja u visokoenergetsko stanje, a zatim oslobađaju svjetlost kada se vrati u niskoenergetsko stanje. To je svjetlost koja ne zrači temperaturom - luminiscencija. Odnosno: tvar apsorbira kratkovalnu svjetlost, ulazi u pobuđeno stanje i emitira dugovalnu svjetlost.
Bilo da se radi o autofluorescenciji tvari, fluorescentne boje ili fluorescentnog proteina izraženog fuzijom, potrebno ga je pobuditi određenom valnom duljinom svjetlosti (Ekcitacija). Nakon što elektroni migriraju i izgube energiju, emitiraju svjetlost određene duge valne duljine (emisija). , koji se može prikupiti sustavom detekcije kako bi se postigla funkcija identifikacije specifične fluorescencije.
Što je fluorescentna kocka?
U promatranju i slikanju fluorescentnim mikroskopom, pobudno svjetlo specifične valne duljine i odgovarajuće dugovalno emisiono svjetlo osigurava fluorescentna svjetlosna kocka, tako da se fluorescentni signal može prikupiti golim okom, ekranom ili kamerom. Stoga fluorescentna svjetlosna kocka određuje što se može otkriti. Ključni uređaj fluorescentnog signala, njegove karakteristike uključuju EX: parametre filtra valne duljine pobude, EM: parametre filtra valne duljine emisije i DM: parametre dihotomnog zrcala. Uzmimo DAPI svjetlosnu kocku integriranog fluorescentnog mikroskopa Revolve kao primjer, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425nm svjetlost se može prenijeti na EM; Filtri EM emisije koriste se za odvajanje fluorescencije koju emitira fluorofor od druge pozadine. Optički elementi za odvajanje svjetlosti. Emisijski filtri propuštaju svjetlost na valnoj duljini fluorescencije kroz dikroično zrcalo dok blokiraju svu drugu svjetlost koja curi iz pobudnog izvora svjetlosti (reflektirana od uzorka ili optike). Valna duljina emitirane svjetlosti veća je od EM koju treba promatrati, to jest, samo svjetlost unutar raspona od 450±25nm ulazi u sustav detekcije. Pravilan odabir EX, EM filtera i DM dihotomija može pomoći istraživačima u postizanju viših omjera signala i šuma (S/N).
