Glavna metoda promatranja optičkim mikroskopom je promatranje fluorescencije
Fluorescencija se odnosi na proces u kojem fluorescentna tvar emitira svjetlost duže valne duljine gotovo istovremeno kada je ozračena svjetlom određene valne duljine (slika 1). Kada svjetlost određene valne duljine (valna duljina pobude) udari u molekulu, poput one u fluoroforu, energiju fotona apsorbiraju elektroni molekule. Zatim, elektroni prelaze iz osnovnog stanja (S0) u višu energetsku razinu, pobuđeno stanje (S1'). Taj se proces naziva ekscitacija①. Elektron ostaje u pobuđenom stanju 10-9–10-8 sekundi, tijekom kojih elektron gubi nešto energije②. Tijekom procesa napuštanja elektrona iz pobuđenog stanja (S1) i vraćanja u osnovno stanje③, preostala energija apsorbirana tijekom procesa pobude se oslobađa.
Vrijeme zadržavanja fluorescentne molekule u pobuđenom stanju je životni vijek fluorescencije, koji je općenito na razini nanosekunde i inherentna je karakteristika same fluorescentne molekule. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), koja koristi tehnologiju fluorescence Lifetime Imaging, naziva se fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Osim snimanja intenziteta fluorescencije, mogu se dobiti detaljnija funkcionalna i točna mjerenja kako bi se dobila molekularna konformacija, međumolekularne interakcije i mikrookruženje molekula. Informacije koje je teško dobiti konvencionalnim optičkim snimanjem.
Drugo važno svojstvo fluorescencije je Stokesov pomak, razlika u valnim duljinama između vrhova ekscitacije i emisije (Slika 2). Tipično je valna duljina emisije duža od valne duljine pobude. To je zato što će elektroni izgubiti dio svoje energije kroz proces opuštanja nakon što se fluorescentna tvar pobudi i prije otpuštanja fotona. Fluorescentne tvari s većim Stokesovim pomacima lakše je promatrati pod fluorescentnim mikroskopom.
Fluorescentna mikroskopija i fluorescentne filtarske kocke
Fluorescentni mikroskop je optički mikroskop koji koristi svojstva fluorescencije za promatranje i slikanje, a naširoko se koristi u raznim područjima kao što su stanična biologija, neurobiologija, botanika, mikrobiologija, patologija i genetika. Prednosti fluorescentnog snimanja su visoka osjetljivost i visoka specifičnost te je vrlo pogodno za promatranje distribucije specifičnih proteina i organela u tkivima i stanicama, proučavanje kolokalizacije i interakcija, praćenje životnih dinamičkih procesa kao što su promjene koncentracije iona itd.
Većina molekula u stanicama ne fluorescira, a da bismo ih vidjeli moraju biti fluorescentno obilježene. Postoje mnoge metode fluorescentnog označavanja, kao što je izravno označavanje (kao što je korištenje DAPI za označavanje DNK), ili imunološko bojenje korištenjem svojstava vezanja antigena antitijela, ili korištenje fluorescentnih proteina (kao što je GFP, zeleni fluorescentni protein) za označavanje ciljnih proteina , i reverzibilno uvezivanje. Sintetičke boje (kao što je Fura-2) i tako dalje.
Trenutačno je fluorescentni mikroskop postao standardna oprema za snimanje u raznim laboratorijima i platformama za snimanje i dobar je pomoćnik u našim svakodnevnim eksperimentima. Fluorescentni mikroskopi uglavnom se dijele u tri kategorije: uspravni fluorescentni mikroskopi (prikladni za rezanje), invertni fluorescentni mikroskopi (prikladni za žive stanice, uzimajući u obzir rezanje), fluorescentni stereoskopi (prikladni za veće primjerke, poput biljaka, zebrica (odrasli/embrij) ), medaka, organi miša/štakora itd.).
Blok fluorescentnog filtra je ključna komponenta mikroskopskog fluorescentnog snimanja. Sastoji se od tri dijela: pobudnog filtra, emisijskog filtra i dikroičnog djelitelja snopa. Ugrađuje se u filterski kotač. Na primjer, Leica DMi8 opremljena je 6-kotačićem filtra položaja (Sl. 3). Broj položaja različitih kotačića mikroskopa bit će različit, a neki mikroskopi koriste stakalce s filtarskim blokom.
Filtarski blok igra važnu ulogu u fluorescentnom prikazivanju: pobudni filtar odabire pobudno svjetlo za pobuđivanje uzorka i blokira svjetlo drugih valnih duljina; svjetlost koja prolazi kroz ekscitacijski filtar prolazi kroz dikroično zrcalo (njegova funkcija je reflektirati ekscitacijsko svjetlo i prenositi fluorescenciju), nakon refleksije je fokusira leća objektiva, ozračuje uzorak i pobuđuje odgovarajuću fluorescenciju, tj. , emitirano svjetlo. Emitirano svjetlo skuplja leća objektiva, prolazi kroz dihroični razdjelnik snopa i dolazi do filtra emisije. Kao što je prikazano na slici 4: valna duljina pobude je 450-490nm, dikroično zrcalo reflektira svjetlost kraću od 510nm, propušta svjetlost dužu od 510nm, a raspon primanja emitirane svjetlosti je 520-560nm.
