Princip, karakteristike i primjena fluorescentnog mikroskopa
Princip i strukturne karakteristike fluorescentnog mikroskopa: fluorescentni mikroskop koristi točkasti izvor svjetlosti s visokom svjetlosnom učinkovitošću za emitiranje određene valne duljine svjetlosti (kao što je ultraljubičasto svjetlo 3650 in ili ljubičasto plavo svjetlo 4200 in) kroz sustav filtera kao pobudu svjetlo za poticanje fluorescencije u uzorku. Nakon što tvar emitira fluorescenciju različitih boja, promatra se kroz povećanje objektiva i okulara. Na taj način, pod jakom kontrastnom pozadinom, čak i ako je fluorescencija vrlo slaba, lako se identificira i ima visoku osjetljivost. Uglavnom se koristi za istraživanje stanične strukture i funkcije te kemijskog sastava. Osnovna struktura fluorescentnog mikroskopa sastoji se od običnog optičkog mikroskopa plus nekih dodataka (kao što je fluorescentni izvor svjetlosti, pobudni filtar, dvobojni razdjelnik snopa i blokirajući filtar, itd.). Fluorescentni izvor svjetlosti—općenito koristite živinu lampu ultravisokog tlaka (50-200W), koja može emitirati svjetlost različitih valnih duljina, ali svaka fluorescentna tvar ima valnu duljinu pobude koja proizvodi najjaču fluorescenciju, tako da filtar pobude (općenito, postoje ultraljubičasti, ljubičasti, plavi i zeleni ekscitacijski filtri), koji dopuštaju samo ekscitacijskoj svjetlosti određene valne duljine da prođe i ozrači uzorak, dok apsorbira drugu svjetlost. Nakon što je svaka tvar ozračena pobudnim svjetlom, emitira vidljivu fluorescenciju s dužom valnom duljinom od valne duljine ozračivanja u vrlo kratkom vremenu. Fluorescencija je specifična i općenito slabija od ekscitacijske svjetlosti. Za promatranje specifične fluorescencije potreban je blokirajući (ili suzbijajući) filtar iza leće objektiva.
Ima dvije funkcije: jedna je apsorbirati i blokirati ulazak pobudne svjetlosti u okular, kako ne bi poremetila fluorescenciju i oštetila oči; drugi je odabrati i pustiti određenu fluorescenciju da prođe, pokazujući određenu fluorescentnu boju. Dva filtra moraju se koristiti zajedno.
Postoje dvije vrste fluorescentnih mikroskopa u smislu njihovih optičkih putanja:
1. Transmisijski fluorescentni mikroskop: Ekscitacijski izvor svjetlosti prolazi kroz materijal uzorka kroz kondenzatorsku leću kako bi se pobudila fluorescencija. Obično se koristi kolektor tamnog polja, a obični kolektor također se može koristiti za podešavanje zrcala tako da se pobudna svjetlost preusmjeri i zaobiđe na uzorak. Ovo je stariji fluorescentni mikroskop. Prednost je što je fluorescencija jaka pri malom povećanju, ali nedostatak je što fluorescencija opada s povećanjem povećanja. Stoga je bolje promatrati materijale većih uzoraka.
2. Epi-fluorescentni mikroskop je nova vrsta fluorescentnog mikroskopa razvijena u moderno doba. Razlika je u tome što pobudna svjetlost pada s leće objektiva na površinu uzorka, odnosno ista leća objektiva koristi se kao kondenzor za osvjetljavanje i leća objektiva za prikupljanje fluorescencije. Dihroični razdjelnik snopa treba dodati na put svjetlosti, koji je 45 stupnjeva udaljen od svjetlosnog urana. Pobuđeno svjetlo se reflektira u leću objektiva i skuplja na uzorku. Fluorescencija koju stvara uzorak i pobudna svjetlost koju reflektira površina leće objektiva i površina pokrovnog stakla ulaze u leću objektiva u isto vrijeme i vraćaju se u dvobojni razdjelnik snopa kako bi se pobudna svjetlost odvojila od fluorescencije , preostalo pobudno svjetlo apsorbiraju blokirajući filtri. Kao što je prelazak na kombinaciju različitih ekscitacijskih filtara/dvobojnog razdjelnika snopa/blokirajućih filtara, može zadovoljiti potrebe različitih proizvoda fluorescentne reakcije. Prednost ovakvog fluorescentnog mikroskopa je što je osvjetljenje vidnog polja ravnomjerno, slika je jasna, a što je veće povećanje, to je fluorescencija jača.
Kako koristiti fluorescentni mikroskop
1. Uključite izvor svjetla i živina žarulja ultravisokog pritiska mora se zagrijavati nekoliko minuta kako bi dosegla najsvjetliju točku.
2. Transmisioni fluorescentni mikroskop treba instalirati potrebni pobudni filtar između izvora svjetlosti i kondenzatora i instalirati odgovarajući blokirajući filtar iza leće objektiva. Epi-fluorescentni mikroskopi trebaju umetnuti potrebni filtar za pobudu/dvobojni razdjelnik snopa/filter za blokiranje u utore na optičkom putu.
3. Promatrajte lećom s malim povećanjem i namjestite središte izvora svjetlosti tako da se nalazi u središtu cijele rasvjetne točke prema uređaju za podešavanje različitih modela fluorescentnih mikroskopa.
4. Postavite djelić uzorka i promatrajte nakon fokusiranja. Treba obratiti pozornost tijekom uporabe: nemojte izravno promatrati krajnjim filtrom kako ne biste oštetili oči; pri promatranju preparata uljnom lećom morate koristiti posebnu uljnu leću bez fluorescencije; nakon što se visokotlačna živina žarulja isključi, ne može se odmah ponovno upaliti, te ju je potrebno ispitati. Može se ponovno pokrenuti nakon 5 minuta, inače će biti nestabilna i utjecati na vijek trajanja živine žarulje.
