Dvofotonska fluorescentna mikroskopija ima mnoge prednosti:
1) Na dulje valne duljine svjetlosti manje utječe raspršenje nego na kraće valne duljine svjetlosti da prodru kroz uzorak;
(2) Fluorescentne molekule izvan žarišne ravnine nisu pobuđene tako da više pobudnog svjetla može doprijeti do žarišne ravnine, tako da pobudno svjetlo može prodrijeti dublje u uzorak;
3) Dulje valne duljine bliskog infracrvenog svjetla manje su toksične za stanice od kraćih valnih duljina;
4) Kada se za promatranje uzorka koristi dvofotonski mikroskop, fotoizbjeljivanje i fototoksičnost prisutni su samo u žarišnoj ravnini. Stoga su dvofotonski mikroskopi prikladniji od jednofotonskih mikroskopa za promatranje debelih uzoraka, za promatranje živih stanica ili za provođenje eksperimenata točkastog fotoizbjeljivanja.
Poznavanje konfokalnog fluorescentnog mikroskopa
Osnovno načelo konfokalnog fluorescentnog mikroskopa: točkasti izvor svjetlosti koristi se za ozračivanje uzorka, formirajući malu, dobro definiranu svjetlosnu točku na žarišnoj ravnini. Fluorescenciju emitiranu iz ove točke nakon ozračivanja prikuplja leća objektiva i šalje natrag u razdjelnik zraka koji se sastoji od dvosmjernog kromatskog zrcala duž izvorne putanje svjetlosti ozračivanja. Razdjelnik snopa šalje fluorescenciju izravno u detektor. I izvor svjetlosti i detektor imaju rupicu ispred sebe, koja se naziva rupica za osvjetljavanje i rupica za otkrivanje. Obje imaju istu geometriju, oko 100-200 nm, i konjugirane su u odnosu na točku svjetlosti na žarišnoj ravnini, tj. točka svjetlosti prolazi kroz niz leća i na kraju se može fokusirati na obje osvjetljavajuće i rupice detektora. Na taj način, svjetlost iz žarišne ravnine može konvergirati unutar otvora sonde, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod žarišne ravnine blokirana izvan otvora sonde i ne može se prikazati. Laser skenira uzorak točku po točku, a fotomultiplikatorska cijev nakon detekcije rupice također dobiva konfokalnu sliku odgovarajuće svjetlosne točke točku po točku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi u računalo, te na kraju konvergira u jasnu sliku. konfokalna slika cijele žarišne ravnine na ekranu.
Svaka slika u žarišnoj ravnini zapravo je optički presjek uzorka, a taj optički presjek uvijek ima određenu debljinu, također poznatu kao optička ploča. Budući da je intenzitet svjetlosti u žarišnoj točki puno veći od intenziteta u nežarišnoj točki, a svjetlost nežarišne ravnine filtrira se rupom, dubina polja konfokalnog sustava aproksimirana je na nuli, a skeniranje duž smjera Z-osi omogućuje optičkoj tomografiji da oblikuje dvodimenzionalni optički presjek uzorka koji se promatra na žarištu. Kombinacijom skeniranja XY ravnine (žarišne ravnine) sa skeniranjem Z-osi (optičke osi), trodimenzionalna slika uzorka može se dobiti skupljanjem uzastopnih slojeva dvodimenzionalnih slika, koje obrađuje specijalizirani računalni softver.
To znači da su rupica za otkrivanje i rupica za izvor svjetlosti uvijek fokusirane na istu točku, tako da fluorescencija pobuđena izvan žarišne ravnine ne može ući u rupicu za detekciju.
Princip rada laserskog konfokalnog lasera jednostavno je izražen da koristi laser kao izvor svjetlosti, na temelju tradicionalnog snimanja fluorescentnim mikroskopom, dodatnog laserskog uređaja za skeniranje i konjugiranog uređaja za fokusiranje, putem računalne kontrole za izvođenje sustava za prikupljanje i obradu digitalne slike.
