Koja je svrha konfokalnog mikroskopa?
1. Nakon napora i poboljšanja naših velikih prethodnika, optički mikroskop je dosegao točku savršenstva. U stvari, obični mikroskopi mogu nam jednostavno i brzo pružiti prekrasne mikroskopske slike. Međutim, dogodio se događaj koji je donio revolucionarnu inovaciju u ovaj gotovo savršen svijet mikroskopa, a to je izum "laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa". Značajka ove nove vrste mikroskopa je da usvaja optički sustav koji samo izvlači informacije o slici na površini gdje je fokus koncentriran i vraća dobivene informacije u memoriju slike dok mijenja fokus, tako da se potpuna 3D informacija može prikazati dobiveno. Jaka slika inteligencije. Ovom metodom moguće je lako dobiti informacije o obliku površine koje se ne mogu potvrditi normalnim mikroskopom. Osim toga, za obične optičke mikroskope, "povećanje razlučivosti" i "produbljivanje dubine fokusa" su kontradiktorni uvjeti, posebno pri velikim povećanjima, ova kontradikcija je izraženija, ali u smislu konfokalnih mikroskopa, ovaj problem se lako rješava.
2. Prednosti konfokalnog optičkog sustava
Shematski dijagram laserskog konfokalnog mikroskopa
Konfokalni optički sustav vrši točkasto osvjetljavanje uzorka, a reflektirano svjetlo također prima točkasti receptor. Kada se uzorak postavi u fokusni položaj, gotovo sva reflektirana svjetlost može doprijeti do fotoreceptora, a kada je uzorak izvan fokusa, reflektirana svjetlost ne može doprijeti do fotoreceptora. Odnosno, u konfokalnom optičkom sustavu izlazi samo slika koja se poklapa sa žarišnom točkom, a svjetlosne točke i beskorisno raspršeno svjetlo bit će zaštićeni.
3. Zašto koristiti laser?
U konfokalnom optičkom sustavu uzorak se osvjetljava u točki, a reflektirano svjetlo također prima točkasti fotoreceptor. Stoga postaje neophodan točkasti izvor svjetlosti. Laseri su vrlo točkasti izvori svjetlosti. U većini slučajeva laserski izvori svjetlosti koriste se kao izvori svjetlosti za konfokalne mikroskope. Osim toga, karakteristike monokromatičnosti, usmjerenosti i izvrsnog oblika laserske zrake također su važni razlozi za njegovu široku primjenu.
4. Promatranje u stvarnom vremenu temeljeno na brzom skeniranju postaje moguće
Za lasersko skeniranje koristi se akustički aktivirana optička otklonska jedinica (Acoustic Optical Deflector, AO element) u horizontalnom smjeru, a Servo Galvano-zrcalo u vertikalnom smjeru. Budući da akusto-optička otklonska jedinica nema mehanički dio za vibracije, može izvoditi skeniranje velikom brzinom i moguće je promatranje na zaslonu monitora u stvarnom vremenu. Ova velika brzina snimanja vrlo je važna stavka koja izravno utječe na brzinu fokusiranja i dohvaćanja položaja.
5. Odnos između položaja fokusa i svjetline
U konfokalnom optičkom sustavu, svjetlina uzorka je najveća kada je uzorak ispravno postavljen u žarišnu poziciju, a njegova svjetlina će se naglo smanjiti prije i poslije (puna linija na slici 4). Osjetljiva selektivnost žarišne ravnine također je princip određivanja smjera visine konfokalnog mikroskopa i širenja žarišne dubine. Nasuprot tome, obični optički mikroskopi nemaju značajne promjene svjetline prije i nakon položaja fokusa.
6. Visoki kontrast, visoka rezolucija
U običnim optičkim mikroskopima, zbog interferencije reflektirane svjetlosti od fokusnog dijela, ono se preklapa s fokusnim slikovnim dijelom, što rezultira smanjenjem kontrasta slike. S druge strane, u konfokalnom optičkom sustavu, raspršena svjetlost izvan žarišne točke i raspršena svjetlost unutar leće objektiva gotovo su potpuno uklonjene, tako da se može dobiti slika s vrlo visokim kontrastom. Osim toga, budući da svjetlost dvaput prolazi kroz leću objektiva, točkasta slika se prvo izoštrava, što također poboljšava moć razlučivosti mikroskopa.
7. Funkcija optičke lokalizacije
U konfokalnom optičkom sustavu, reflektirana svjetlost osim točke koja se poklapa sa žarišnom točkom zaštićena je mikroporama. Stoga se pri promatranju trodimenzionalnog uzorka stvara slika kao da je uzorak presječen žarišnom ravninom (slika 5). Taj je učinak poznat kao optička lokalizacija i jedna je od posebnosti konfokalnih optičkih sustava.
8. Funkcija mobilnog fokusiranja memorije
Takozvana reflektirana svjetlost izvan žarišne točke zaštićena je mikroporama. S druge strane, može se smatrati da se sve točke na slici koju formira konfokalni optički sustav poklapaju sa žarišnom točkom. Dakle, ako se trodimenzionalni uzorak pomiče duž Z-osi (optičke osi), slike se akumuliraju i pohranjuju u memoriju, te će se na kraju dobiti slika koju čine cijeli uzorak i žarište. Funkcija beskonačnog produbljivanja dubine fokusa na ovaj način naziva se funkcija mobilne memorije.
9. Funkcija mjerenja oblika površine
Što se tiče funkcije pomicanja fokusa, oblik površine uzorka može se mjeriti na beskontaktni način dodavanjem kruga za snimanje visine površine. Na temelju ove funkcije moguće je zabilježiti koordinate Z-osi formirane maksimalnom vrijednošću osvjetljenja u svakom pikselu, te se na temelju tih informacija mogu dobiti informacije vezane uz oblik površine uzorka.
10. Visokoprecizna funkcija mjerenja mikro veličine
Jedinica za primanje svjetlosti koristi 1-dimenzionalni CCD senzor slike, tako da na nju ne utječe nagib uređaja za skeniranje, tako da se može izvršiti visoko precizno mjerenje. Osim toga, zahvaljujući korištenju funkcije memorije pomaka fokusa s podesivom dubinom fokusa (produbljivanje), može se eliminirati pogreška mjerenja uzrokovana pomakom fokusa.
11. Analiza trodimenzionalne slike
Pomoću funkcije mjerenja oblika površine možete jednostavno stvoriti trodimenzionalnu sliku površine uzorka. I ne samo to, već također može izvesti različite analize kao što su: mjerenje hrapavosti površine, površine, volumena, površine, kružnosti, radijusa, maksimalne duljine, perimetra, težišta, tomografske slike, FFT transformacije, mjerenja širine linija itd. .
Laserski konfokalni skenirajući mikroskop može se koristiti ne samo za promatranje stanične morfologije, već i za kvantitativnu analizu unutarstaničnih biokemijskih komponenti, statistiku optičke gustoće i mjerenje stanične morfologije.
