Zašto trebam koristiti konfokalni mikroskop?
1. Optički mikroskop je usavršen trudom i poboljšanjima naših velikih prethodnika. Zapravo, uobičajeni mikroskop može nam jednostavno i brzo pružiti prekrasne mikroskopske slike. Međutim, događaj koji je revolucionirao svijet gotovo savršenih mikroskopa bio je izum "laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa". Ovu novu vrstu mikroskopa karakterizira optički sustav koji izvlači informaciju o slici samo s površine na kojoj je koncentriran fokus, a promjenom fokusa uz vraćanje stečene informacije u memoriju slike moguće je dobiti oštru sliku s pune 3-dimenzionalne informacije. Na taj način moguće je jednostavno dobiti informacije o obliku površine koje se ne mogu potvrditi konvencionalnim mikroskopom. Osim toga, dok su "povećanje rezolucije" i "produbljivanje dubine fokusa" sukobljeni uvjeti za konvencionalne optičke mikroskope, posebno pri velikom povećanju, ovaj problem je riješen s konfokalnim mikroskopima.
2. Prednosti konfokalnog optičkog sustava
Shematski dijagram laserskog konfokalnog mikroskopa
Konfokalni optički sustav je točkasto osvjetljenje uzorka, dok se reflektirana svjetlost također prima pomoću točkastog receptora. Kada se uzorak postavi u žarišnu točku, gotovo sva reflektirana svjetlost dopire do fotoreceptora, a kada je uzorak izvan fokusa, reflektirana svjetlost ne može doprijeti do fotoreceptora. Drugim riječima, u konfokalnom optičkom sustavu izlazi samo slika koja se poklapa sa žarišnom točkom, a mrlje i beskorisno raspršeno svjetlo su blokirani.
3. Zašto koristiti laser?
U konfokalnom optičkom sustavu, uzorak je osvijetljen u točki, a reflektirano svjetlo prima točkasti senzor. Stoga je neophodan točkasti izvor svjetlosti. Laseri su uglavnom točkasti izvor svjetlosti. U većini slučajeva, izvor svjetlosti za konfokalne mikroskope je laserski izvor svjetlosti. Osim toga, monokromatičnost, usmjerenost i odličan oblik zrake lasera važni su razlozi za njihovu široku primjenu.
4. Moguće je promatranje u stvarnom vremenu temeljeno na brzom skeniranju.
Za lasersko skeniranje koristi se akustična optička otklonska jedinica (Acoustic Optical Deflector, AO prime) u horizontalnom smjeru, a servo-elektronički kontrolirano zrcalo za skeniranje snopa (Servo Galvano-mirror) u vertikalnom smjeru. Budući da u AO deflektoru nema mehaničkih vibracija, moguće je skeniranje velikom brzinom i moguće je promatranje na ekranu monitora u stvarnom vremenu. Velika brzina ove kamere je vrlo bitna stavka koja izravno utječe na brzinu fokusa i dohvaćanja pozicije.
5. Odnos između položaja fokusa i svjetline
U konfokalnom optičkom sustavu, uzorak je ispravno postavljen u žarišnu poziciju kada je svjetlina zui velika, ispred i iza njega, njegova će se svjetlina oštro smanjiti (slika 4 puna linija). Ova osjetljiva selektivnost žarišne ravnine je princip koji stoji iza visinske orijentacije konfokalnog mikroskopa i dubine širenja fokusa. Nasuprot tome, uobičajeni optički mikroskopi ne pokazuju nikakvu značajnu promjenu u svjetlini prije i poslije položaja žarišta (točkasta linija na slici 4).
6. Visoki kontrast, visoka razlučivost
U konvencionalnom optičkom mikroskopu, reflektirana svjetlost iz dijela mikroskopa koji nije u fokusu interferira i preklapa se s dijelom mikroskopa za žarišnu sliku, što rezultira smanjenjem kontrasta slike. Nasuprot tome, u konfokalnom optičkom sustavu, raspršena svjetlost izvan žarišne točke i unutar leće objektiva je gotovo potpuno uklonjena, što rezultira slikama s vrlo visokim kontrastom. Osim toga, moć razlučivosti mikroskopa je poboljšana jer svjetlost dvaput prolazi kroz leću objektiva, izoštravajući točkastu sliku.
7. Funkcija optičke lokalizacije
U konfokalnom optičkom sustavu, reflektirana svjetlost je zaštićena mikrootvorom u točki koja nije žarišna točka. Kao rezultat toga, kada se promatra trodimenzionalni uzorak, slika se formira kao da je uzorak izrezan žarišnom točkom (slika 5). Taj se efekt naziva optička lokalizacija i jedno je od obilježja konfokalnih optičkih sustava.
