Osnovna struktura konfokalne fluorescentne mikroskopije
(1) Modul za skeniranje
Modul za skeniranje uglavnom se sastoji od svjetlosne trake s rupicama (kontrolira debljinu optičkih rezova), spektroskopa (mijenja smjer širenja svjetlosti prema valnoj duljini), emisijskog fluorescentnog kolorimetra (odabire svjetlost unutar određenog raspona valne duljine za detekciju) i detektor (fotomultiplikatorska cijev). Mješovita fluorescencija u fluorescentnom uzorku ulazi u skener, a nakon što je odabere svjetlosna traka s rupicama za otkrivanje, spektrometar i kolorimetar, dijeli se na različite monokromatske fluorescencije, koje se detektiraju u različitim fluorescentnim kanalima i tvore odgovarajuće konfokalne slike. Istovremeno se na zaslonu računala može prikazati nekoliko paralelnih monokromatskih fluorescentnih slika i njihovih kompozitnih slika.
(2) Sustav fluorescentne mikroskopije
Mikroskop je glavna komponenta LSCM-a, koja je povezana s kvalitetom slike sustava. Optički put mikroskopa može se jednostavno umetnuti u beskonačno udaljeni optički sustav s optičkim opcijama bez utjecaja na kvalitetu slike i točnost mjerenja. Objektiv bi trebao biti apokromatski objektiv s ravnim poljem velike numeričke aperture, koji je koristan za dobivanje fluorescencije i jasne slike. Računalo bi trebalo automatski kontrolirati konverziju grupe leća objektiva, odabir grupe filtara u boji, podešavanje pomaka pozornice i zaključavanje memorije žarišne ravnine.
Fluorescentni mikroskop koji se koristi u laserskoj skenirajućoj konfokalnoj mikroskopiji općenito je isti kao i konvencionalni fluorescentni mikroskop, ali ima svoje karakteristike: treba ga spojiti na skener kako bi laser mogao ući u objektiv mikroskopa kako bi ozračio uzorak i napravio fluorescencija koju emitira uzorak dolazi do detektora; Potreban je uređaj za pretvorbu puta svjetlosti, koji pretvara živine žarulje u lasere, a intenzitet svjetlosti živine lampe se može podešavati.
(3) Uobičajeni laseri
Laserski izvori koji se koriste u laserskoj skenirajućoj konfokalnoj mikroskopiji uključuju jednolaserske i multilaserske sustave, a najčešće korišteni laseri uključuju sljedeće tri vrste:
Poluvodički laser: 405 nm (blizu ultraljubičaste spektralne linije)
Argon ionski laser: 457nm, 477nm, 488nm, 514nm (plavo zeleno svjetlo)
He-Ne laser: 543 nm (zeleno svjetlo He-Ne zeleni laser) 633 nm (crveno svjetlo He-Ne crveni laser)
UV laser (UV laser): 351 nm, 364 nm (UV svjetlo)
(4) Pomoćna oprema
Sustavi hlađenja zrakom, vodom hlađeni i regulirani izvori napajanja.
Osnovni princip rada laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa je prvo emitiranje određene valne duljine pobudne svjetlosti iz lasera. Nakon pojačanja, svjetlost prolazi kroz osvijetljenu svjetlosnu traku rupice u skeneru i formira točkasti izvor svjetlosti. Leća objektiva fokusira se na žarišnu ravninu uzorka, a odgovarajuće osvijetljene točke na uzorku se pobuđuju i emitiraju fluorescenciju. Nakon što prođe kroz svjetlosnu traku otvora za otkrivanje, dolazi do detektora i prikazuje se na zaslonu računala za nadzor. Na taj se način cjelovita konfokalna slika formira fluorescentnim slikama svake točke uzorka na žarišnoj ravnini, što se naziva svjetlosni rez.
