Usporedba i značajke fluorescentnih mikroskopa i konvencionalnih optičkih mikroskopa
Fluorescentni mikroskop razlikuje se od običnog optičkog mikroskopa. Umjesto promatranja uzoraka pod osvjetljenjem iz konvencionalnog izvora svjetlosti, koristi se svjetlom određene valne duljine (obično ultraljubičasto ili plavo-ljubičasto svjetlo) za pobuđivanje fluorescentnih tvari unutar uzorka, uzrokujući njihovo emitiranje fluorescencije. Stoga izvor svjetlosti fluorescentnog mikroskopa ne služi za izravno osvjetljenje; djeluje kao izvor energije za pobuđivanje endogenih fluorescentnih tvari u uzorku. Uzorak možemo promatrati ne zbog osvjetljenja izvora, već zahvaljujući fluorescenciji koju emitiraju fluorescentne tvari u uzorku nakon apsorpcije pobudne svjetlosti.
Iz toga slijedi da je ključna značajka fluorescentnog mikroskopa njegov izvor svjetlosti, koji može opskrbiti obilnu pobudnu svjetlost unutar određenog raspona valnih duljina kako bi se osigurao dovoljan intenzitet pobude za fluorescentne tvari u ispitnom uzorku. U međuvremenu, fluorescentni mikroskop mora biti opremljen odgovarajućim sustavom filtera. Kao bitan alat za fluorescentnu histokemiju, uglavnom se sastoji od izvora svjetlosti ultravisokog tlaka, kompleta filtara (uključujući filtre pobude i filtre barijere), optičkog sustava i fotografskog sustava. Djeluje tako da pobuđuje uzorke svjetlom određene valne duljine da proizvede fluorescenciju.
Metode ekscitacije fluorescencije: Klasificira se prema rasponu valnih duljina u UV ekscitaciju (metoda ultraljubičastog osvjetljenja) i BV ekscitaciju (metoda plavo-ljubičastog svjetla). UV ekscitacija koristi skoro ultraljubičasto svjetlo kraće od 400 nm za ekscitaciju. Nije uključena vidljiva pobudna svjetlost, tako da opažena fluorescencija pokazuje svojstvenu fluorescenciju boje. To olakšava razlikovanje specifične fluorescencije na uzorku od autofluorescencije pozadinskog tkiva.
BV metoda ekscitacije: ekscitacija se provodi svjetlom u rasponu od ultraljubičastog do plavog svjetla, centriranog na 404 nm i 434 nm. Budući da u ovoj metodi plavo svjetlo ozračuje uzorak, filter za isključivanje fluorescentnog sustava za promatranje mora potpuno blokirati plavo svjetlo dok u potpunosti propušta potrebnu zelenu i žutu fluorescenciju. Ova se metoda primjenjuje na fluorokrome koji se koriste u tehnikama fluorescentnih protutijela. Maksimalna valna duljina apsorpcije pobudnog svjetla i maksimalna valna duljina emisije fluorescencije relativno su bliske, pa su za pobuđivanje BV potrebni filtri s oštrim rezom. Plavo svjetlo se ovdje koristi kao pobudno svjetlo, što donosi visoku učinkovitost apsorpcije fluorokroma i daje svjetlije slike. Nedostatak mu je što se fluorescencija ispod 500 nm ne može detektirati, a signali iznad 500 nm cijeloj slici daju žutu nijansu. U testovima fluorescentnih antitijela, specifičnost se uglavnom procjenjuje prema karakterističnoj boji fluorokroma. Stoga, kada se procjenjuje suptilna specifičnost, gornji nedostatak metode ekscitacije BV može imati značajan utjecaj.
