Određivanje broja mikroorganizama - metoda izravnog brojanja mikroskopa!
Rast populacije bakterija očituje se povećanjem broja stanica ili povećanjem stanične mase. Metode za određivanje broja stanica uključuju metodu izravnog brojanja mikroskopom, metodu brojanja kolonija na ploči, metodu omjera fotoelektričnog ulja, metodu maksimalne vjerojatnosti i metodu membranske filtracije. Metode mjerenja stanične tvari uključuju određivanje suhe mase stanice, određivanje određenih staničnih komponenti kao što su sadržaj dušika, RNA i DNA te određivanje metabolita. Ukratko, postoje mnoge metode za mjerenje rasta mikroorganizama, svaka ima svoje prednosti i nedostatke, a treba ih odabrati prema specifičnoj situaciji. Ovaj eksperiment uglavnom uvodi metodu izravnog brojanja mikroskopa koja se obično koristi u proizvodnji i znanstvenim istraživanjima.
1. Zahtjevi namjene
1. Pojasniti princip brojanja krvnih stanica.
2. Ovladati metodom brojanja mikroorganizama pomoću brojača krvnih zrnaca.
2. Osnovna načela
Metoda izravnog brojanja mikroskopom jednostavna je, brza i intuitivna metoda za izravno brojanje male količine suspenzije uzorka koji se testira na posebnom stakalcu s određenom površinom i volumenom (također poznat kao brojač bakterija). Metode. Trenutno, najčešće korišteni brojači bakterija u zemlji i inozemstvu su: ploča za brojanje krvnih stanica, Peteroff-Hauser brojač bakterija i Hawksleyjev brojač bakterija, itd. Mogu se koristiti za brojanje kvasca, bakterija, spora plijesni i drugih suspenzija, i osnovni princip je isti. Posljednje dvije vrste brojača bakterija imaju ukupni volumen od 0.02 mm3 nakon što su prekrivene pokrovnim staklom, a udaljenost između pokrovnog stakla i stakalca je samo 0,02 mm, tako da ulje imerzijska leća objektiva može se koristiti za promatranje i promatranje malih stanica kao što su bakterije. računati. Osim ovih bakteriometara, postoji i metoda procjene omjera površine razmaza i površine vidnog polja promatranog izravno pod mikroskopom, koja se općenito koristi za bakteriološku pretragu mlijeka. Prednosti mikroskopske metode izravnog brojanja su intuitivna, brza i jednostavna za rukovanje. Međutim, nedostatak ove metode je što je izmjereni rezultat obično zbroj mrtvih i živih stanica. Trenutačno postoje neke metode za prevladavanje ovog nedostatka, kao što je kombinacija mikrokomorne kulture bojenja živih bakterija (kratko vrijeme) i dodavanje inhibitora stanične diobe kako bi se postigla svrha brojanja samo živih bakterija.
U ovom eksperimentu, hemocitometar je korišten kao primjer za izravno mikroskopsko brojanje. Za korištenje druge dvije vrste brojača bakterija, pogledajte upute svakog proizvođača. Brojanje izravno pod mikroskopom s hemocitometrom često je korištena metoda za brojanje mikroorganizama. Ploča za brojanje je poseban stakleni tobogan, na kojem su tri platforme oblikovane s četiri utora; šira platforma u sredini podijeljena je na dvije polovice kratkim poprečnim prorezom, a sa svake strane platforme je rešetka. Svaka mreža podijeljena je na devet velikih kvadrata, a veliki kvadrat u sredini je soba za brojanje. Struktura ploče za brojanje krvnih stanica prikazana je na slici l{{{{10}}}}. Ljestvica sobe za brojanje općenito ima dvije specifikacije, jedna je veliki kvadrat podijeljen na 25 srednjih kvadrata, a svaki srednji kvadrat je podijeljen na 16 malih kvadrata (slika 15-2); drugi je veliki kvadrat. Kvadrat je podijeljen na 16 srednjih kvadrata, a svaki srednji kvadrat je podijeljen na 25 malih kvadrata, ali bez obzira kakva je ploča za brojanje, u svakom velikom kvadratu nalazi se 400 malih kvadrata. Duljina stranice svakog velikog kvadrata je 1 mm, a površina svakog velikog kvadrata je 1 mm2. Nakon prekrivanja pokrovnim staklom, visina između pokrovnog stakla i predmetnog stakla je 0,1 mm, tako da je volumen komore za brojanje 0,lmm3 (tisućinka mililitra). Slika 15-1 Struktura ploče za brojanje krvnih stanica (1) Slika 15-2 Struktura ploče za brojanje krvnih stanica (2) A. Pogled sprijeda; B. Uzdužni presjek; Povećana mreža, veliki kvadrat u sredini je komora za brojanje 1. Krvne stanice Ploča za brojanje; 2. Pokrovno staklo; 3. Kada brojite u komori za brojanje, obično izbrojite ukupan broj bakterija u pet kvadrata, zatim izračunajte prosjek svakog kvadrata i pomnožite s 25 ili 16 kako biste dobili Ukupan broj bakterija u velikom kvadratu se zatim pretvara u ukupan broj bakterija u 1 ml otopine bakterija. Neka ukupan broj bakterija u pet kvadrata bude A, a omjer razrjeđenja bakterijske otopine B. Ako je to ploča za brojanje s 25 kvadrata, ukupan broj bakterija u 1 mL bakterijske otopine {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(komada) Slično, ako se radi o ploči za brojanje sa 16 srednjih kvadrata, ukupan broj bakterija u 1 mL otopine bakterija=A/ 5×16×104×B=32000A·B (komadi)
3. Oprema
1. Bakterije
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumenti ili drugo posuđe
Hemocitometar, mikroskop, pokrovno stakalce, sterilna kapilarna kapaljka.
4. Radni koraci
1. Priprema bakterijske suspenzije
Saccharomyces cerevisiae pripremljena je u bakterijsku suspenziju odgovarajuće koncentracije sa sterilnom fiziološkom otopinom.
2. Prostorija za brojanje mikroskopa
Prije dodavanja uzoraka, mikroskopski pregledajte komoru za brojanje ploče za brojanje. Ako ima prljavštine, potrebno ju je očistiti i osušiti prije brojanja.
3. Dodajte uzorak
Pokrijte čisti i suhi hemocitometar pokrovnim stakalcem, a zatim sterilnom kapilarnom kapaljkom kapnite malu kap protresene suspenzije Saccharomyces cerevisiae s ruba pokrovnog stakalca i pustite da se bakterijska otopina automatski kreće duž otvora kapilarnom osmozom. Ulaskom u prostoriju za brojanje, opća soba za brojanje može se napuniti bakterijskom tekućinom. Prilikom uzorkovanja prvo protresite otopinu bakterija; prilikom dodavanja uzoraka u komori za brojanje ne smiju se stvarati mjehurići zraka.
4. Mikroskopsko brojanje
Nakon dodavanja uzorka, ostanite mirni 5 minuta, zatim postavite hemocitometar na postolje mikroskopa, prvo pronađite mjesto komore za brojanje mikroskopom male snage, a zatim prijeđite na mikroskop velike snage za brojanje. Na odgovarajući način prilagodite intenzitet svjetla mikroskopa. Za mikroskope koji koriste zrcala za osvjetljavanje, pazite da ne skrenete s jedne strane svjetla, inače neće biti lako jasno vidjeti kvadratne linije sobe za brojanje u vidnom polju ili će se vidjeti samo okomite ili vodoravne linije biti viđen. Ako se prije brojanja ustanovi da je bakterijska otopina previše koncentrirana ili previše razrijeđena, potrebno je ponovno prilagoditi razrjeđenje prije brojanja. Općenito, za razrjeđivanje uzorka potrebno je oko 5 do 10 bakterija u svakoj maloj stanici. Svaka komora za brojanje odabire 5 srednjih ćelija (po izboru 4 kuta i jedna srednja ćelija u sredini) za brojanje. Ćelije koje se nalaze na liniji rešetke općenito se broje samo na gornjoj i desnoj liniji. U slučaju pupanja kvasca, kada pupoljak dosegne polovicu matične stanice, broji se kao dvije bakterijske stanice. Za brojanje uzorka izračunajte sadržaj bakterija u uzorku izračunavanjem prosječne vrijednosti iz dvije komore za brojanje.
5. Operite krvnu sliku
Nakon upotrebe ploču za brojanje krvnih zrnaca isperite vodom iz slavine, ne trljajte tvrdim predmetima, a nakon pranja je osušite sami ili sušilom za kosu. Mikroskopski pregled kako bi se uočilo postoje li zaostale bakterije ili drugi sedimenti u svakoj maloj stanici. Ako nije čist, mora se više puta prati dok ne bude čist.
