Razlike i karakteristike između fluorescentnih mikroskopa i običnih optičkih mikroskopa
Fluorescentni mikroskop razlikuje se od običnog optičkog mikroskopa po tome što ne promatra uzorke pod osvjetljenjem uobičajenih izvora svjetlosti. Umjesto toga, koristi određenu valnu duljinu svjetlosti (obično ultraljubičasto svjetlo, plavo ljubičasto svjetlo) za pobuđivanje fluorescentnih tvari unutar uzorka pod mikroskopom, uzrokujući njihovo emitiranje fluorescencije. Stoga uloga izvora svjetlosti u fluorescentnom mikroskopu nije izravno osvjetljenje, već kao izvor energije za pobuđivanje fluorescentnih tvari unutar uzorka. Razlog zašto možemo promatrati uzorke nije zbog osvjetljenja izvora svjetlosti, već fenomena fluorescencije koju pokazuju fluorescentne tvari unutar uzorka nakon apsorpcije pobuđene svjetlosne energije. Iz ovoga se može vidjeti da je karakteristika fluorescentne mikroskopije uglavnom to što njen izvor svjetlosti može dati veliku količinu pobudne svjetlosti u određenom rasponu valnih duljina, tako da fluorescentne tvari u uzorku mogu dobiti potreban intenzitet pobudne svjetlosti. Istovremeno, fluorescentni mikroskopi moraju imati odgovarajuće sustave filtera. Fluorescentni mikroskop temeljni je alat u kemiji fluorescentnog tkiva. Sastoji se od glavnih komponenti kao što su izvor svjetlosti ultra-visokog napona, sustav filtara (uključujući filtarske ploče za pobudu i supresiju), optički sustav i sustav fotografije. Koristi svjetlost određene valne duljine za pobuđivanje uzorka i emitiranje fluorescencije.
1. Metode pobuđivanja fluorescencije: Prema rasponu valnih duljina svjetlosti, postoje dvije vrste: UV pobudna metoda (upotrebom ultraljubičastog osvjetljenja) i BV pobudna metoda (pomoću plavoljubičastog svjetla). Metoda UV ekscitacije za ekscitaciju koristi ultraljubičasto svjetlo kraće od 400 nm. Ova metoda nema vidljivu pobudnu svjetlost, tako da promatrana fluorescencija pokazuje svojstvenu fluorescenciju boje, što olakšava razlikovanje specifične fluorescencije na uzorku od vlastite fluorescencije pozadinskog tkiva.
2. BV metoda ekscitacije: uključuje ekscitaciju od ultraljubičastog do plavog svjetla sa središtem na 404 nm i 434 nm. Ova metoda koristi plavo svjetlo za ozračivanje uzorka, tako da filter za-isključivanje sustava za promatranje fluorescencije mora koristiti filter koji može potpuno blokirati plavo svjetlo i potpuno proći kroz potrebnu zelenu i žutu fluorescenciju. Fluorescentni pigmenti koji se koriste za metodu fluorescentnih antitijela. Maksimalna valna duljina apsorpcije pobudne svjetlosti i maksimalna valna duljina emisije fluorescencije relativno su bliske, tako da filtar koji se koristi u BV metodi pobude mora koristiti filter s oštrim rezom. Ova metoda može koristiti plavo svjetlo kao pobudno svjetlo, tako da je apsorpcijska učinkovitost fluorescentnih pigmenata visoka i mogu se dobiti svjetlije slike. Nedostatak je što se fluorescencija ispod 500 nm ne može vidjeti, dok fluorescencija iznad 500 nm čini da cijela slika izgleda žuto. U metodi fluorescentnih antitijela, specifičnost je uglavnom određena bojom jedinstvenom za fluorescentne pigmente, tako da kada se raspravlja o suptilnoj specifičnosti, gore navedeni nedostaci metode pobuđivanja BV često imaju značajan utjecaj.
