Razlike između fluorescentnih mikroskopa i običnih svjetlosnih mikroskopa
Fluorescentni mikroskopi razlikuju se od konvencionalnih optičkih mikroskopa. Umjesto promatranja uzoraka svjetlom iz običnog izvora svjetla, oni koriste svjetlo određene valne duljine (obično ultraljubičasto ili plavo-ljubičasto svjetlo) za pobuđivanje fluorescentnih tvari unutar uzorka na stakalcu mikroskopa, uzrokujući da te tvari emitiraju fluorescenciju. Stoga izvor svjetlosti fluorescentnog mikroskopa ne osvjetljava izravno uzorak; djeluje kao izvor energije za pobuđivanje endogenih fluorescentnih tvari u uzorku. Uzorak ne možemo vidjeti zbog osvjetljenja samog izvora svjetlosti, već zato što fluorescentne tvari unutar uzorka apsorbiraju pobudnu svjetlosnu energiju i zatim emitiraju fluorescenciju.
Iz toga slijedi da je ključna značajka fluorescentnog mikroskopa da njegov izvor svjetlosti može dati pobudno svjetlo određenog pojasa valne duljine, omogućujući fluorescentnim tvarima u ispitivanom uzorku da emitiraju fluorescenciju dovoljnog intenziteta. U međuvremenu, fluorescentni mikroskop mora biti opremljen odgovarajućim sustavom filtera. To je bitan instrument za fluorescentnu histokemiju. Fluorescencijski mikroskop uglavnom se sastoji od izvora svjetlosti ultravisokog tlaka, sustava filtara (uključujući filtre pobude i filtre barijere), optičkog sustava i fotografskog sustava. Djeluje korištenjem svjetlosti određene valne duljine za pobuđivanje fluorescentnih tvari.
① Metode pobude fluorescencije Prema rasponu valnih duljina pobudnog svjetla, postoje dvije vrste: metoda pobude UV (metoda ultraljubičastog osvjetljenja) i metoda pobude BV (metoda plavo-ljubičastog osvjetljenja). Metoda pobude UV koristi ultraljubičasto svjetlo kraće od 400 nm za pobuđivanje. Generira nevidljivu fluorescenciju, tako da promatrana fluorescencija dolazi od samog uzorka. Ova metoda lako razlikuje specifičnu fluorescenciju od autofluorescencije pozadine.
② Metoda pobude BV Metoda pobude BV koristi pobudno svjetlo u rasponu od ljubičaste do plave sa središtem na 404 nm i 434 nm. Budući da se za ozračivanje uzorka koristi plavo svjetlo, sustav filtara pobude za ovu metodu mora u potpunosti blokirati plavo svjetlo i dopustiti prolaz samo potrebnom zelenom i žutom svjetlu. Za bojenje fluorescentnim antitijelima, maksimalna valna duljina apsorpcije pobudnog svjetla je blizu maksimalne valne duljine emisije fluorescentne boje. Iz tog razloga, set filtara za BV pobudu mora koristiti granični filtar za isključivanje. Ova metoda koristi plavo svjetlo za pobuđivanje, tako da je učinkovitost prikupljanja fluorescencije relativno visoka i mogu se dobiti svjetlije slike. Nedostatak mu je što se fluorescencija iznad 500 nm ne može detektirati, a iznad 500 nm mogu se vidjeti samo žuto-zelene slike. Kod fluorescentnog bojenja antitijela, procjena specifičnosti uvelike se oslanja na informacije o boji, tako da nedostatak metode pobuđivanja BV može biti veliko ograničenje kada se raspravlja o suptilnoj specifičnosti.
