Povećanje prednosti višefotonske laserske skenirajuće mikroskopije
Laserska skenirajuća multifotonska mikroskopija veliko je poboljšanje u odnosu na optičku mikroskopiju. Može promatrati duboku strukturu živih stanica, fiksnih stanica i tkiva, te može dobiti jasne i oštre višeslojne strukture Z ravnine, odnosno optičke presjeke, iz kojih može konstruirati trodimenzionalnu čvrstu strukturu uzorka. Konfokalna mikroskopija koristi laserski izvor svjetlosti koji, nakon ekspanzije, ispunjava cijelu stražnju žarišnu ravninu leće objektiva, a zatim prolazi kroz sustav leća objektiva da bi konvergirao u vrlo malu točku na žarišnoj ravnini uzorka. Ovisno o numeričkoj aperturi leće objektiva, promjer najsvjetlije točke osvjetljenja je oko 0.25 ~ 0.8μm, a dubina je oko 0.5 ~ 1.5μm . Veličina konfokalne točke ovisi o dizajnu mikroskopa, valnoj duljini lasera, karakteristikama objektiva, postavkama statusa jedinice za skeniranje i svojstvima uzorka. Raspon osvjetljenja i dubina osvjetljenja poljskog mikroskopa su veliki, dok je osvjetljenje konfokalnog mikroskopa koncentrirano na precizan fokus na žarišnoj ravnini. Najosnovnija prednost konfokalne mikroskopije je da može izvesti fino optičko rezanje debelih fluorescentnih uzoraka (koji mogu doseći 50 μm ili više), a debljina rezova je oko 0,5 do 1,5 μm. Slike serijskih optičkih presjeka mogu se dobiti pomicanjem uzorka gore-dolje pomoću sofisticiranog koračnog motora Z-osi mikroskopa. Prikupljanje slikovnih informacija kontrolira se u preciznoj ravnini bez ometanja signala emitiranih s drugih mjesta na uzorku. Nakon uklanjanja utjecaja pozadinske fluorescencije i povećanja omjera signala i šuma, kontrast i razlučivost konfokalnih slika značajno su poboljšani u usporedbi s tradicionalnim fluorescentnim slikama osvijetljenim poljem. U mnogim uzorcima, mnoge su zamršene strukturne komponente isprepletene kako bi tvorile složene sustave, ali jednom kada se prikupi dovoljno optičkih presjeka, možemo ih rekonstruirati u tri dimenzije pomoću softvera. Ova eksperimentalna metoda naširoko se koristi u biološkim istraživanjima za razjašnjavanje složenih strukturnih i funkcionalnih odnosa između stanica ili tkiva.
