Razlike i karakteristike fluorescentnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa
Fluorescentni mikroskop i obični optički mikroskop razlikuju se, uzorak se ne promatra osvjetljenjem običnog izvora svjetlosti, već korištenjem određene valne duljine svjetlosti (obično ultraljubičasto, plavo-ljubičasto svjetlo) pobuđivanje fluorescentnog materijala unutar uzorka pod mikroskopom, tako da fluorescencija izvora svjetlosti fluorescentnog mikroskopa ne djeluje kao izravno osvjetljenje, već kao neka vrsta pobude fluorescentnog materijala unutar uzorka izvora energije. Razlog zašto možemo promatrati uzorak nije zbog osvjetljenja izvora svjetlosti, već fenomena fluorescencije koju predstavlja fluorescentni materijal u uzorku nakon apsorpcije svjetlosne energije pobude. Može se vidjeti da karakteristike fluorescentnog mikroskopa, uglavnom njegov izvor svjetlosti, mogu dati veliki broj specifičnih raspona valnih duljina pobudnog svjetla, tako da fluorescentni materijal unutar ispitivanog uzorka može dobiti potreban intenzitet pobudnog svjetla. Istovremeno, fluorescentni mikroskop mora imati odgovarajući sustav filtera. Fluorescentni mikroskop osnovni je alat za fluorescentnu histokemiju. Sastoji se od izvora svjetlosti ultra-visokog tlaka, sustava filtera (uključujući filtarsku ploču za pobuđivanje i potiskivanje), optičkog sustava i fotografskog sustava i drugih glavnih komponenti, korištenje određene valne duljine svjetlosti za poticanje uzorka na emitiranje fluorescencije.
1. način pobuđivanja fluorescencije: prema rasponu valnih duljina svjetlosti se dijeli na metodu UV pobude (koristeći ultraljubičasto osvjetljenje) i BV metodu pobuđivanja (pomoću plavoljubičastog svjetla) dvije vrste metode pobude UV-a su kraće od 400 nm blizu ultraljubičastog svjetla za uzbuđenje. U ovoj metodi nema vidljive ekscitacijske svjetlosti, tako da promatrana fluorescencija pokazuje svojstvenu fluorescenciju boje, a lako je razlikovati specifičnu fluorescenciju na uzorku od samofluorescencije pozadinskog tkiva.
2. BV metoda ekscitacije: Metoda je usmjerena na 404 nm, 434 nm od ultraljubičastog do plavog svjetla za ekscitaciju. Ova metoda koristi plavo svjetlo za ozračivanje uzorka, tako da cut-off filter sustava za promatranje fluorescencije mora koristiti filter koji može potpuno blokirati plavo svjetlo i može adekvatno propustiti željenu zelenu i žutu fluorescenciju. Fluorescentni pigmenti za metodu fluorescentnih antitijela. Budući da su valna duljina maksimalne apsorpcije ekscitacijske svjetlosti i valna duljina maksimalne emisije fluorescencije blizu jedna drugoj, filtri koji se koriste u BV ekscitacijskoj metodi moraju biti filtri s oštrim prekidom. Ova metoda koristi plavo svjetlo kao pobudno svjetlo, tako da je učinkovitost apsorpcije fluorokroma veća i može se dobiti svjetlija slika. Nedostatak je što se fluorescencija ispod 500 nm ne može vidjeti, a iznad 500 nm cijela slika izgleda žuto. U metodi fluorescentnih protutijela, većina specifičnosti prosuđuje se prema jedinstvenoj boji fluorokroma, tako da nedostaci gore opisane metode ekscitacije BV imaju tendenciju da budu izuzetno utjecajni kada se raspravlja o suptilnoj specifičnosti.
