Kako se fluorescentna mikroskopija razlikuje od konvencionalne mikroskopije
Nedavno sam pokušao napraviti neke zamrznute dijelove miševa, a sada moram upotrijebiti fluorescentni mikroskop da vidim je li virus koji sam ubrizgao u željeno područje mozga. Potrebno je ukratko proučiti neke osnovne principe fluorescentne mikroskopije, a ja ću ih također podijeliti ovdje.
Fluorescencijski mikroskop koristi ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetla za osvjetljavanje predmeta koji se ispituje, uzrokujući da objekt emitira izvor svjetla, a zatim promatra predmet pod mikroskopom. Uglavnom se koristi za imunofluorescentne stanice, a sastoji se od izvora svjetlosti, sustava filtarskih ploča i optičkog sustava za promatranje fluorescentne slike uzorka povećanjem okulara i objektiva. Pogledajmo razliku između ovog fluorescentnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa.
1. U pogledu metoda osvjetljenja
Metoda osvjetljenja fluorescentnog mikroskopa općenito koristi metodu padajućeg snopa, što znači da se izvor svjetlosti projicira na ispitni uzorak kroz leću objektiva.
2. Što se tiče rezolucije
Fluorescentna mikroskopija koristi ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetla, s relativno kratkom valnom duljinom, ali većom rezolucijom od običnih optičkih mikroskopa.
3. Razlike na filteru
Fluorescentni mikroskop koristi dva posebna filtera, jedan ispred izvora svjetlosti za filtriranje vidljive svjetlosti, a drugi između objektiva i okulara za filtriranje ultraljubičastog svjetla, koje može zaštititi oči.
Fluorescentna mikroskopija također je vrsta optičkog mikroskopa, uglavnom zato što je valna duljina koju pobuđuje fluorescentna mikroskopija kratka, što dovodi do razlika u strukturi i upotrebi fluorescentne mikroskopije i obične mikroskopije. Većina fluorescentnih mikroskopa ima dobru funkciju hvatanja slabog svjetla, tako da je njihova sposobnost snimanja dobra i pod izrazito slabom fluorescencijom. Osim toga, kontinuiranim poboljšanjem fluorescentne mikroskopije posljednjih godina, šum je također značajno smanjen. Stoga se sve više primjenjuje fluorescentni mikroskop.
Znanja vezana uz dvofotonsku fluorescentnu mikroskopiju
Osnovno načelo dvofotonske ekscitacije je da pri visokoj gustoći fotona fluorescentne molekule mogu istovremeno apsorbirati dva fotona dugih valnih duljina, te nakon kratkog razdoblja takozvanog trajanja pobuđenog stanja emitirati foton kraće valne duljine; Njegov učinak je isti kao korištenje fotona s valnom duljinom koja je pola duge valne duljine za pobuđivanje fluorescentnih molekula. Dvofotonska ekscitacija zahtijeva visoku gustoću fotona, a kako bi se izbjeglo oštećenje stanica, u dvofotonskom mikroskopu koristi se visokoenergetski impulsni laser sa zaključanim modom. Laser koji emitira ovaj tip lasera ima visoku vršnu energiju i nisku prosječnu energiju, sa širinom impulsa od samo 100 femtosekundi i frekvencijom do 80 do 100 megaherca. Kada se koristi objektiv s velikom numeričkom aperturom za fokusiranje fotona pulsirajućeg lasera, gustoća fotona u žarišnoj točki objektiva je najveća, a dvofotonska ekscitacija javlja se samo u žarišnoj točki objektiva. Stoga dvofotonski mikroskop ne zahtijeva konfokalne rupice, što poboljšava učinkovitost detekcije fluorescencije.
U općem fenomenu fluorescencije, zbog niske gustoće fotona pobude, fluorescentna molekula može apsorbirati samo jedan foton u isto vrijeme, a zatim emitirati jedan fluorescentni foton kroz tranziciju zračenja, što se naziva fluorescencija jednog fotona. Za proces pobuđivanja fluorescencije koji koristi laser kao izvor svjetlosti, može doći do fenomena dvofotonske ili čak višefotonske fluorescencije. U ovom trenutku, korišteni izvor pobudne svjetlosti je visokog intenziteta, a gustoća fotona zadovoljava zahtjev da fluorescentne molekule apsorbiraju dva fotona istovremeno. U procesu korištenja tipičnog lasera kao izvora pobudne svjetlosti, gustoća fotona još uvijek nije dovoljna za generiranje fenomena dvofotonske apsorpcije. Obično se koriste femtosekundni pulsni laseri, čija trenutna snaga može doseći razinu od megavata. Stoga je valna duljina dvofotonske fluorescencije kraća od valne duljine ekscitacije, što je ekvivalentno učinku izazvanom ekscitacijom valne duljine polovične ekscitacije.
