Uvod u fluorescentnu mikroskopiju
Fluorescentna mikroskopija je ozračivanje objekta obojenog fluoresceinom svjetlom kratke valne duljine, tako da se pobudi da proizvede dugovalnu fluorescenciju, a zatim se promatra. U fluorescentnom mikroskopu, pobudno svjetlo određene valne duljine mora biti odabrano od svjetla iluminacije uzorka da bi se stvorila fluorescencija, a zatim se fluorescencija mora odvojiti od miješanog svjetla pobudnog svjetla i fluorescencije za promatranje. Stoga filtarski sustav igra iznimno važnu ulogu u odabiru određene valne duljine. Fluorescentni mikroskopi imaju široku primjenu u biologiji, medicini i drugim područjima.
1. Glavne komponente fluorescentnog mikroskopa:
(A) Izvor svjetlosti: Izvor svjetlosti zrači svjetlost različitih valnih duljina (od ultraljubičaste do infracrvene). the
(B) Ekscitacijski filtar izvor svjetlosti: kroz svjetlost određene valne duljine koja može uzrokovati fluorescenciju uzorka, dok blokira svjetlost koja je beskorisna za pobuđivanje fluorescencije. the
(C) Fluorescentni uzorci: općenito obojeni fluorescentnim pigmentima. the
(D) Blokirajući filtar: blokira pobudno svjetlo koje uzorak ne apsorbira i selektivno prenosi fluorescenciju, a neke se valne duljine selektivno prenose u fluorescenciji.
the
2. Klasifikacija fluorescentnih mikroskopa:
Fluorescentni mikroskopi općenito se dijele na dvije vrste: transmisijske i epiemisione:
a. Vrsta prijenosa: pobudna svjetlost dolazi s dna predmeta koji se pregledava, a kondenzator je kondenzator tamnog polja, tako da pobudna svjetlost ne ulazi u leću objektiva, ali fluorescencija ulazi u leću objektiva. Svijetao je pri malom povećanju, ali je taman pri velikom povećanju. Teško je raditi u uronjenju u ulje i centriranju. Osobito je teško odrediti raspon osvjetljenja pri malim povećanjima, ali može dobiti vrlo tamnu pozadinu vidnog polja. Vrsta prijenosa ne koristi se za netransparentne objekte. the
b. Epi-tip: Tip prijenosa trenutno je gotovo eliminiran. Većina novih fluorescentnih mikroskopa su epi-tipa. Izvor svjetlosti dolazi odozgo nad predmetom koji se pregledava, a na optičkom putu nalazi se razdjelnik snopa, tako da je prikladan i za prozirne i za neprozirne objekte za pregled. Budući da leća objektiva djeluje kao sabirna leća, ne samo da je jednostavna za rukovanje, već također može postići ravnomjerno osvjetljenje cijelog vidnog polja od malog povećanja do velikog povećanja. the
the
3. Mjere opreza za fluoroskopiju
a. Dugotrajno zračenje pobudnog svjetla uzrokovat će slabljenje i gašenje fluorescencije, stoga skratite vrijeme promatranja što je više moguće i koristite pregradu da pokrijete pobudno svjetlo kada privremeno ne promatrate. the
b. Kada promatrate s uljnom imerzijskom lećom, koristite "nefluorescentno ulje". the
c. Fluorescencija je gotovo uvijek slaba i treba je provoditi u tamnoj prostoriji. the
d. Najbolje je ugraditi stabilizator napona u napajanje, inače nestabilan napon ne samo da će smanjiti vijek trajanja živine žarulje, već će utjecati i na učinak pregleda mikroskopa. the
the
4. Korištenje fluorescentne mikroskopije
1. Zahtjevi za pripremu uzoraka fluorescentnog mikroskopa
a. Stakleni tobogan
Debljina predmetnog stakla trebala bi biti između 0,8 i 1,2 mm. Predebelo stakalce će s jedne strane apsorbirati više svjetla, a s druge strane, ekscitacijsko svjetlo se ne može koncentrirati na preparat. Stakalca moraju biti glatka, ujednačene debljine i bez očite autofluorescencije. Ponekad se koriste stakalci od kvarcnog stakla. the
b. Pokrovno staklo
Debljina pokrovnog stakla je oko 0,17 mm, glatko. Za pojačavanje pobudne svjetlosti može se koristiti i suho pokrivno staklo, posebno pokrivno staklo presvučeno s nekoliko slojeva tvari (kao što je magnezijev fluorid) koje imaju različite interferencijske učinke na svjetlost različitih valnih duljina, što može uzrokovati fluorescencija ide glatko. Pobudno svjetlo prolazi, a reflektirano pobudno svjetlo pobuđuje uzorak. the
c. Primjerak
Kriške tkiva ili drugi uzorci ne smiju biti predebeli. Ako je predebeo, većina ekscitacijske svjetlosti potrošit će se u donjem dijelu preparata, dok se gornji dio koji izravno promatra leća objektiva ne može u potpunosti ekscitirati. Osim toga, preklapanje stanica ili nečistoća se prekrivaju, što utječe na prosudbu. the
d. Sredstvo za montažu
Glicerin se obično koristi kao sredstvo za montiranje, koje ne smije imati autofluorescenciju, bezbojno i prozirno, a svjetlina fluorescencije je svjetlija pri pH 8.5-9.5, i nije lako brzo izblijediti. Stoga se jednaka mješavina glicerola i 0.5mol/L otopine karbonatnog pufera s pH od 90 do 9,5 obično koristi kao sredstvo za montiranje. the
e. ulje za ogledalo
Općenito, imerzijsko ulje mora se koristiti pri promatranju uzoraka fluorescentnim mikroskopima s tamnim poljem i uljnim imersijskim imerzijskim objektivima. Najbolje je koristiti specijalno nefluorescentno ulje za ogledala, koje se može zamijeniti i gore navedenim glicerinom, a može se koristiti i tekući parafin, ali je indeks loma nizak, što malo utječe na kvalitetu slike.
