Značajke i primjena laserskog konfokalnog mikroskopa
Dok je u normalnom mikroskopu ravnina slike promatranja izolirana od susjednih aksijalnih ravnina preklapanjem žarišne ravnine leće objektiva s detektorom, u konfokalnom mikroskopu ta se izolacija postiže osvjetljavanjem uzorka s difrakcijski ograničenom točkom svjetlo i filtriranje zalutalog svjetla korištenjem rupice na putu sakupljenog svjetla u konjugiranom fokusu ove točke svjetla kako bi se postigla ova izolacija i time poboljšala razlučivost.
Samo svjetlost koja se reflektira natrag od konjugiranog sloja uzorka može proći kroz rupicu na putu skupljajućeg svjetla, dok ostatak nevažnih refleksija sloja uzorka blokira rupica. Ovo daje značajno povećanje razlučivosti. Dolje je prikazana usporedba višedimenzionalne fluorescentne mikroskopije i konfokalne mikroskopije istog debelog uzorka. Kada se niz slika snimi u različitim žarišnim ravninama, proizvodi se slika koja se obično naziva "z-skup", koja pokazuje dobitke rezolucije i kontrasta koje daje konfokalna mikroskopija i temeljne razloge za te dobitke. Može se vidjeti da ispitivanje slike na vrhu hrpe gdje je ravnina snimanja iznad tkiva otkriva veliku količinu raspršenog svjetla na fluorescentnoj slici, dok slika konfokalnog mikroskopa izgleda crno. Ovo smanjenje PSF-a u aksijalnom smjeru izravno pridonosi razlici u razlučivosti opaženoj na optičkom sučelju u sredini z-skupa.
Optičko skeniranje presjeka
Još jedna značajka laserske skenirajuće konfokalne mikroskopije je da je to tehnika skeniranja slike. Tradicionalne tehnike osvjetljavanja širokog polja osvjetljavaju cijeli uzorak tako da se slika može uhvatiti izravno golim okom ili detektorom, ali LSCM koristi jednu ili više fokusiranih zraka svjetlosti za skeniranje kroz uzorak, tako da se rezultirajuća slika naziva optički rez, kao što je prikazano na sljedećem dijagramu. Dolje je prikazana razlika između tradicionalnog osvjetljenja širokog polja i konfokalnog osvjetljenja laserskim skeniranjem.
Stoga je na donjoj slici prikazan praktičan način suvremene konfokalne mikroskopije. Ekscitacijsko svjetlo iz lasera prolazi kroz dikroično zrcalo i skenira se kroz par galvanometarskih zrcala u x-smjeru i y-smjeru uzorka, a ekscitacija (ili refleksija) uzorka prolazi kroz rupicu u PMT detektor koji će se snimiti, a snimljenu skeniranu sliku računalo rekonstruira kako bi proizvelo stvarnu sliku uzorka.
