Priprema i promatranje bioloških uzoraka za elektronske mikroskope
Razlučivost mikroskopa ovisi o valnoj duljini korištenog svjetla. Elektronski mikroskop, koji se pojavio 1933. godine, postigao je značajno veću rezoluciju od optičkog mikroskopa zahvaljujući korištenju elektronskih zraka valnih duljina puno kraćih od vidljive svjetlosti kao izvora svjetlosti. Različiti izvori svjetlosti također određuju niz razlika između elektronskih i optičkih mikroskopa.
Na temelju razlika u principima snimanja elektronskim snopom i načinima na koji oni djeluju na uzorke, moderni elektronski mikroskopi razvili su se u mnoge vrste. Trenutno se najčešće koriste transmisijski elektronski mikroskopi i skenirajući elektronski mikroskopi. Prvo ima ukupno povećanje koje može varirati između 1000-10000000 puta, dok drugo ima ukupno povećanje koje može varirati između 20-300000 puta. Ovaj eksperiment uglavnom uvodi pripremu dviju vrsta uzoraka mikroskopa, transmisijsku elektronsku mikroskopiju i skenirajuću elektronsku mikroskopiju.
2, Oprema
1. Soj Escherichia coli je sklon.
2. Otopina ili reagens: pentil acetat, koncentrirana sumporna kiselina, bezvodni etanol, sterilna voda, 2% vodena otopina natrijevog fosfovolframata (pH 6,5-8,0), 0,3% otopina polivinil formaldehida (otopljenog u kloroformu), citokrom c, amonijev acetat, plazmid pBR322.
3. Instrumenti ili drugi alati uključuju obične optičke mikroskope, bakrene mreže, porculanske lijevke, čaše, petrijeve zdjelice, sterilne kapaljke, sterilne pincete, pribadače, stakalce, ploče za brojanje, strojeve za vakuumsko oblaganje, sušače kritičnih točaka itd.
3, Radni koraci
(1) Priprema i promatranje uzoraka za transmisijsku elektronsku mikroskopiju
1. Obrada metalne mreže
Uzorak optičkog mikroskopa stavlja se na predmetno staklo radi promatranja. Međutim, u prijenosnom zrcalu, budući da elektroni ne mogu prodrijeti kroz staklenu ploču, mrežasti materijal može se koristiti samo kao nosač, koji se obično naziva nosiva mreža. Noseća mreža može se podijeliti u različite specifikacije zbog različitih materijala i oblika, među kojima se obično koristi bakrena mreža s 200-400 oka (broj rupa). Bakrenu mrežicu treba tretirati prije upotrebe kako bi se uklonila sva prljavština i održavala čistom, inače će to utjecati na kvalitetu pratećeg filma i jasnoću fotografija uzoraka. Bakrena mrežica od 400 mesh koja se koristi u ovom eksperimentu može se tretirati sljedećom metodom: prvo se namoči i pluta pentil acetatom nekoliko sati, zatim se ispere nekoliko puta destiliranom vodom i na kraju bakrena mrežica uroni i ispliva u bezvodni etanol radi dehidracije. Ako bakrena mreža još uvijek nije čista nakon gore navedenih metoda, može se natopiti u razrijeđenoj koncentriranoj sumpornoj kiselini (1:1) 1-2 minute ili kuhati u 1% otopini NaOH nekoliko minuta, isprati nekoliko puta destiliranom vodom, a zatim dehidrirati u bezvodnom etanolu za kasniju upotrebu.
