Priprema i promatranje bioloških uzoraka za elektronsku mikroskopiju
Razlučivost mikroskopa ovisi o valnoj duljini korištenog svjetla. Elektronski mikroskop, koji se počeo pojavljivati 1933. godine, kao izvor svjetlosti koristi snop elektrona valne duljine mnogo kraće od valne duljine vidljive svjetlosti, tako da je rezolucija koju može postići znatno poboljšana u usporedbi s onom optičkog mikroskopa. Razlika u izvorima svjetlosti također određuje niz razlika između elektronskih i optičkih mikroskopa.
U skladu s razlikama u principima snimanja elektronskim snopom i različitim načinima djelovanja na uzorke, moderni elektronski mikroskopi razvili su se u više vrsta. Trenutno se najčešće koriste transmisijski elektronski mikroskopi i pretražni elektronski mikroskopi. Ukupno povećanje prvog može biti između 1000-1000000. Ukupno povećanje potonjeg može varirati između 20 i 300000 puta. Ovaj eksperiment uglavnom predstavlja pripremu dviju vrsta uzoraka mikroskopa, transmisijskog elektronskog mikroskopa i skenirajućeg elektronskog mikroskopa.
2. Oprema
1. Bakterija Escherichia coli (Escherichia coli) nagnuta.
2. Otopina ili reagens amil acetat, koncentrirana sumporna kiselina, apsolutni etanol, sterilna voda, 2% natrijev fosfovolframat (pH 6.5-8.0) vodena otopina, 0.3% polietilen formaldehid (topiv u kloroformu) otopina, stanice Pigment c, amonijev acetat, plazmid pBR322.
3. Instrumenti ili drugo posuđe: obični optički mikroskop, bakrena mrežica, porculanski lijevak, čaša, zdjelica, sterilna kapaljka, sterilna pinceta, igle, stakalca, ploča za brojanje, stroj za vakumiranje, sušilica za kritične točke itd.
3. Radni koraci
(1) Priprema uzorka i promatranje za transmisijsku elektronsku mikroskopiju
1. Obrada metalne mreže
Uzorak za optičku mikroskopiju stavlja se na predmetno staklo radi promatranja. Međutim, u transmisijskoj elektronskoj mikroskopiji, budući da elektroni ne mogu prodrijeti kroz staklenu ploču, mrežasti materijali mogu se koristiti samo kao nosači, koji se obično nazivaju mreže nosača. Noseća mreža može se podijeliti u mnogo različitih specifikacija zbog različitih materijala i oblika, među kojima se najčešće koristi 200-400 mreža (broj rupa) bakrena mreža. Bakrenu mrežicu prije upotrebe potrebno je tretirati kako bi se uklonila prljavština i održala čistom, inače će to utjecati na kvalitetu potpornog filma i jasnoću fotografija uzoraka. Ovaj eksperiment koristi 400-mrežastu bakrenu mrežicu, koja se može tretirati na sljedeći način: prvo je namočite i izbijelite amil acetatom nekoliko sati, zatim je nekoliko puta isperite destiliranom vodom, a zatim je namočite u apsolutnom etanolu na dehidracija. Ako bakrena mrežica još uvijek nije čista nakon gore navedenih metoda, možete je potopiti u razrijeđenu koncentriranu sumpornu kiselinu (1:1) 1 do 2 minute ili kuhati u 1% otopini NaOH nekoliko minuta, isprati je destiliranom vode nekoliko puta, a zatim ga stavite u bezvodni dehidriran u etanolu i ostavite sa strane.
2. Priprema potporne membrane
Prilikom promatranja uzoraka, mreža za nošenje također treba biti prekrivena slojem nestrukturiranog jednoličnog filma, inače će mali uzorci iscuriti iz rupa na mrežici za nošenje. Ova folija se obično naziva potporna folija ili noseća folija. Nosivi film trebao bi biti proziran za elektrone, a njegova debljina općenito bi trebala biti manja od 20 nm; pod utjecajem elektronskog snopa, film također treba imati određenu mehaničku čvrstoću kako bi održao strukturnu stabilnost i imao dobru toplinsku vodljivost; osim toga, potporna mreža treba se koristiti u elektronskoj mikroskopiji. Ispod ne smije biti vidljive strukture, ne smije biti kemijske reakcije s uzorkom koji se nosi, niti ometati promatranje uzorka. Njegova debljina je općenito oko 15 nm. Noseći film može biti plastični film (kao što je kolodijski film, polietilen formaldehidni film, itd.), karbonski film ili metalni film (kao što je berilijev film, itd.). U normalnim radnim uvjetima, plastična folija može zadovoljiti zahtjeve. Među plastičnim filmovima, kolodijski film je relativno jednostavan za pripremu, ali njegova čvrstoća nije tako dobra kao polietilen formaldehidni film.
