Princip i strukturne značajke fluorescentnih mikroskopa
Izvor fluorescentnog svjetla općenito koristi živinu žarulju ultravisokog tlaka (50–200 W), koja emitira svjetlost različitih valnih duljina. Međutim, svaka fluorescentna tvar ima specifičnu valnu duljinu pobude koja stvara intenzivnu fluorescenciju. Iz tog razloga potreban je ekscitacijski filtar (obično dostupan u ultraljubičastom, ljubičastom, plavom i zelenom tipu) koji omogućuje prolaz samo ekscitacijskom svjetlu određene valne duljine i zrači uzorak, dok apsorbira sve ostale valne duljine.
Kada je ozračena pobudnim svjetlom, svaka tvar emitira vidljivu fluorescenciju s dužom valnom duljinom od pobudnog svjetla u iznimno kratkom vremenu. Fluorescencija je vrlo specifična i općenito slabija od ekscitacijske svjetlosti. Da biste promatrali ovu specifičnu fluorescenciju, iza leće objektiva mora se postaviti barijerni (ili supresijski) filtar. Služi u dvije svrhe: prvo, apsorbira i blokira pobudno svjetlo da uđe u okular kako bi se izbjeglo ometanje promatranja fluorescencije i oštećenje očiju; drugo, selektivno prenosi specifičnu fluorescenciju kako bi proizveo jasnu fluorescentnu boju. Dvije vrste filtara moraju biti odabrane i korištene u odgovarajućim parovima.
Fluorescentni mikroskopi dijele se u dvije vrste na temelju njihove optičke putanje:
1. Fluorescencijski mikroskop propuštenog svjetla
U ovom dizajnu, pobudni izvor svjetlosti prolazi kroz kondenzator i materijal uzorka kako bi pobudio fluorescenciju. Obično se koristi kondenzator tamnog polja, iako se može primijeniti i standardni kondenzator; reflektirajuće zrcalo je podešeno za preusmjeravanje i bočno zračenje ekscitacijske svjetlosti na uzorak. Ovo je relativno stariji tip fluorescentnog mikroskopa. Njegova prednost je jaka fluorescencija pri malom povećanju, dok mu je nedostatak što se intenzitet fluorescencije smanjuje s povećanjem. Stoga je prikladniji za promatranje materijala većih uzoraka.
2. Epifluorescentni mikroskop
Ovo je moderna, novorazvijena vrsta fluorescentnog mikroskopa. Za razliku od dizajna propusne svjetlosti, pobudna svjetlost projicira se prema dolje kroz leću objektiva na površinu uzorka - ista leća objektiva služi i kao kondenzator osvjetljenja i kao objektiv za prikupljanje fluorescencije. Dihroični razdjelnik zraka ugrađen je u optički put pod kutom od 45 stupnjeva u odnosu na optičku os. Ekscitacijsko svjetlo se reflektira u leću objektiva i fokusira na uzorak. Fluorescencija koju stvara uzorak, zajedno s pobudnim svjetlom reflektiranim od površine leće objektiva i pokrovnog stakalca, istovremeno ulazi u leću objektiva i vraća se u dikroični razdjelnik zraka, koji odvaja pobudno svjetlo od fluorescencije. Preostalo pobudno svjetlo tada apsorbira zaštitni filter.
Zamjenom filtarskih blokova s različitim kombinacijama ekscitacijskog filtra, dikroičnog djelitelja snopa i barijernog filtra mogu se zadovoljiti zahtjevi za različite produkte fluorescentne reakcije. Prednosti ove vrste fluorescentnog mikroskopa uključuju ravnomjerno osvjetljenje polja, oštru sliku i povećanje intenziteta fluorescencije pri većim povećanjima.
