Pomicanje granica mikroskopije visoke razlučivosti: samoporavnavajuća mikroskopija
Ultraprecizna mikroskopija koja nadilazi ograničenja mikroskopa super rezolucije koji je dobio Nobelovu nagradu omogućit će znanstvenicima izravno mjerenje udaljenosti između pojedinačnih molekula.
Medicinski istraživači na Sveučilištu New South Wales postigli su rezoluciju bez presedana u mikroskopiji jedne molekule za otkrivanje interakcija između pojedinačnih molekula unutar netaknutih stanica.
Nobelova nagrada za kemiju 2014. dodijeljena je za razvoj tehnologije fluorescentne mikroskopije super rezolucije, koja je mikroskopistima omogućila prvi molekularni pogled na unutrašnjost stanice, značajku koja pruža nove molekularne poglede na složene biološke sustave i procese.
Sada su granice detekcije mikroskopije jedne molekule ponovno pomaknute, a detalji su objavljeni u posljednjem izdanju Science Advances.
Bilo je moguće promatrati i pratiti pojedinačne molekule s mikroskopima ultravisoke rezolucije, ali interakcije između tih molekula događaju se na razini koja je najmanje četiri puta manja od one koju razlučuju postojeći mikroskopi s jednom molekulom.
"Razlog zbog kojeg mikroskopi s jednom molekulom obično imaju točnost lokalizacije od oko 20 do 30 nanometara obično je to što se mikroskop zapravo pomiče kada detektira signale. To dovodi do nesigurnosti. Koristeći postojeće instrumente super rezolucije, ne možemo utvrditi je li jedan protein vezan za drugi jer je udaljenost između njih kraća od neizvjesnosti u njihovim položajima."
Kako bi riješio ovaj problem, tim je izgradio automatiziranu petlju povratne sprege unutar jednomolekulskog mikroskopa koji detektira i preusmjerava optički put i pozornicu zrcala.
"Nije važno što radite s ovim mikroskopom, on u osnovi pronalazi povratni put s nanometarskom preciznošću. To je pametan mikroskop. Može učiniti sve što operater ili servisni inženjer treba učiniti i to može učiniti 12 puta u sekundi. " rekao je prof. Goss.
Mjerenje udaljenosti između proteina
S dizajnom i metodologijom navedenim u ovom radu, tim UNSW-a dizajnirao je sustav povratnih informacija koji je kompatibilan s postojećim mikroskopima i pruža maksimalnu fleksibilnost za pripremu uzoraka.
"Ovo je vrlo jednostavno i elegantno rješenje za veliki problem snimanja. Upravo smo napravili mikroskop unutar mikroskopa i sve što smo učinili bilo je poravnavanje glavnog mikroskopa. Jednostavnost i praktičnost rješenja koje smo pronašli njegova je prava snaga. Lako je klonirajte sustav i brzo usvojite nove tehnologije." rekao je prof. Goss.
Kako bi demonstrirali korisnost svog ultrapreciznog jednomolekulskog mikroskopa s povratnom spregom, istraživači su ga koristili za izravna mjerenja udaljenosti između signalnih proteina u T stanicama. Uobičajena pretpostavka u staničnoj imunologiji je da ove imunološke stanice ostaju u stanju mirovanja kada je receptor T-stanice blizu druge molekule koja djeluje kao kočnica.
Njihova visokoprecizna mikroskopija uspjela je pokazati da su dvije signalne molekule zapravo dalje odvojene jedna od druge u aktiviranim T-stanicama, otpuštajući kočnicu i uključivši signalizaciju T-staničnog receptora.
Prof. Goss je rekao: "Konvencionalne mikroskopske tehnike ne bi mogle točno izmjeriti tako malu promjenu jer se udaljenost između ovih signalnih molekula u mirujućim i aktiviranim T stanicama razlikuje za samo 4-7 nanometara."
"Ovo također pokazuje koliko su ti signalni mehanizmi osjetljivi na prostornu izolaciju. Da bismo identificirali takve regulacijske procese, moramo izvršiti precizna mjerenja udaljenosti, što ovaj mikroskop omogućuje. Ovi rezultati pokazuju da je tehnologija u fazi otkrića i da se ne može proizvesti ni na koji način Drugi nacin."
