Tehnike bojenja i mikroskopsko promatranje mikroorganizama
Jednostavno bojenje bakterija
1 Ciljevi
1.1 Naučiti osnovne tehnike mikrobnog razmaza i bojenja.
1.2 Ovladati jednostavnom metodom bojenja bakterija.
1.3 Upoznati morfološke karakteristike bakterija, te učvrstiti naučenost korištenja uljnog zrcala i tehnika aseptičnog rada.
2 Princip Razmaz i bojenje bakterija je osnovna tehnika u mikrobiološkim eksperimentima. Stanice bakterija su male i prozirne, teško ih je prepoznati pod običnim svjetlosnim mikroskopom i potrebno ih je bojati. Upotreba jedne boje za bojenje bakterija, tako da obojeni organizam i pozadina stvaraju jasnu razliku u boji, tako da se njihova morfologija i struktura mogu jasnije uočiti. Ova metoda je jednostavna za izvođenje i pogodna je za promatranje općeg oblika organizma i rasporeda bakterija. Alkalne boje obično se koriste za jednostavno bojenje, jer su u neutralnim, alkalnim ili slabo kiselim otopinama bakterijske stanice obično negativno nabijene, a kada su alkalne boje ionizirane, dio njihovih molekula za bojenje je pozitivno nabijen, tako da je dio za bojenje alkalnih boja može se lako vezati za bakterije kako bi bakterije obojile. Obojene bakterijske stanice u oštrom su kontrastu s pozadinom i lakše ih je prepoznati pod mikroskopom. Uobičajeno korištene boje za jednostavno bojenje uključuju merocijanin plavo, kristalno ljubičasto i bazično crveno. Kada bakterijska razgradnja šećera proizvodi kiselinu tako da se pH medija smanjuje, pozitivni naboj bakterija se povećava, a zatim se može koristiti u crvenom, kiselom crvenom ili Kongo crvenom i drugim kiselim bojama. Bakterije se moraju fiksirati prije bojanja. Njegova je svrha dvojaka: jedan je ubiti bakterije i natjerati ih da prianjaju na stakalce; drugi je povećati njegov afinitet za boju. Uobičajeno se koriste dvije metode: zagrijavanje i kemijska fiksacija. Pokušajte zadržati izvornu morfologiju stanica prilikom fiksiranja.
3 Materijali
3.1 Soj Bacillus subtilis 12-18h hranjiva kultura na agaru, Staphylococcus aureus oko 24h kultura na hranjivom agaru, Escherichia coli 24h kultura na hranjivom agaru, pekarski kvasac nagnuta kultura na agaru.
3.2 Mrlja Lueova alkalna metilensko plava mrlja (ili kristalno ljubičasta mrlja amonijevim oksaltom), crvena mrlja od spoja karbolne kiseline.
3.3 Instrumenti ili drugi pribor Mikroskop, alkoholna lampa, stakalce, inokulacijski prsten, držač stakalca, dvoslojna boca (napunjena cedrovim uljem i ksilenom), papir za mikroskop, fiziološka otopina ili destilirana voda, itd.
4 Postupak Razmaz → sušenje → fiksacija → bojenje → pranje → sušenje → mikroskopski pregled.
5 koraka
5.1 bris Uzmite dva čista stakalca bez ulja, svako s malom kapi fiziološke otopine (ili destilirane vode) u sredini stakalca pod aseptičkim uvjetima, s inokulacijskim prstenom za aseptičko djelovanje Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus i Escherichia coli koso ubrati malo mahovine u kapljici vode, miješati i obložiti filmom. Ako je bakterijska suspenzija (ili tekuća kultura) razmaz, može se koristiti za inokulaciju 2 do 3 prstena izravno na predmetno stakalce. Imajte na umu da fiziološka otopina (destilirana voda) i uzeti bakterije ne bi trebalo biti previše i rasporediti ravnomjerno, ne previše gusta.
5.2 Sušenje Sušiti prirodno na sobnoj temperaturi. Može se sušiti i laganim zagrijavanjem iznad alkoholne lampe s premazanom stranom prema gore. Ipak, nemojte se previše približavati plamenu jer će previsoka temperatura uništiti morfologiju bakterija.
5.3 Učvršćivanje Ako se koristi toplinsko sušenje, fiksiranje i sušenje kombiniraju se u jedan korak na isti način kao i sušenje. Namazati, osušiti i toplinski fiksirati.
5.4 Bojanje Postavite stakalce ravno na policu za stakalce, dodajte 1 do 2 kapi otopine za bojenje na razmaz (prikladna je otopina za bojenje koja samo pokriva film za razmaz). Obojite razmaz Lü's Basic Mellanox Blue 1~2 minute i Carbonate Red (ili amonium oxalate Crystal Violet) oko 1 minutu.
5.5 Ispiranje Izlijte otopinu za bojenje i nježno ispirite vodom iz slavine s jednog kraja stakalca sve dok voda koja teče s razmaza ne postane bezbojna. Prilikom ispiranja ne dopustite da voda teče izravno kako bi oprala premazanu površinu. Protok vode ne smije biti prebrz ili prevelik kako bi se izbjeglo pomicanje razmazanog filma.
5.6 Sušenje Otresite kapljice vode na predmetnom stakalcu da se prirodno osuše, osušite fenom ili upijajućim papirom za upijanje suhog (pazite da ne obrišete tijelo bakterije). 5.7 Mikroskopski pregled Bris se osuši i pregleda mikroskopski. Razmaz mora biti potpuno suh prije nego što se može promatrati uljnim mikroskopom.
6 Rezultati Nacrtajte morfologiju E. coli i Micrococcus garciniae nakon jednog bojenja.
Mrlja po Gramu
1 Namjena
1.1 Razumjeti načelo bojenja po Gramu i njegovu važnost u klasifikaciji i identifikaciji bakterija.
1.2 Naučiti i savladati tehniku bojenja po Gramu i učvrstiti naučenost korištenja uljne leće svjetlosnog mikroskopa.
