Razlika između pozitivnog i negativnog faznog kontrasta u mikroskopu
Ovisno o konfiguraciji i prirodi faznog prstena smještenog u stražnjoj žarišnoj ravnini objektiva, uzorci se mogu promatrati u pozitivnom ili negativnom faznom kontrastu. Ovaj interaktivni vodič proučava odnos između okruživanja (S), difrakcije (D) i rezultirajućih svijetlih čestica (P valovi), kao i mikroskopije s pozitivnim i negativnim faznim kontrastom. Osim toga, prikazana je i geometrija fazne ploče i reprezentativne slike uzoraka.
Kada ljudi sada to koriste u svom radu, većina istraživača je u negativnoj razlici, a sada pozitivna razlika ne igra veliku ulogu u trenutnom znanstveno-istraživačkom radu.
Vodič inicijalizira faznu sliku nasumično odabranim uzorkom koji se pojavljuje u prozoru Phase Contrast Image, a odgovarajući valni odnos prikazan je u lijevom susjedu prozora slike. Kako biste upravljali vodičem, upotrijebite kursor miša za pomicanje prijevoda između pozitivnog i negativnog faznog kontrasta ili klizača načina faznog kontrasta jakog osvjetljenja. Kada se klizač prevede, slike koje se pojavljuju u prozoru slike faznog kontrasta mijenjaju način na koji se uzorak pojavljuje u trenutnom načinu snimanja slike koji postavlja klizač. Također, ispod grafikona valnog oblika nalazi se fazna ploča koja mijenja oblik kako bi odgovarala načinu snimanja odabranim klizačem. Za pregled novog uzorka koristite padajući izbornik Odabrani uzorak za odabir drugog uzorka.
Grafički prikaz konfiguracije fazne ploče, valnih odnosa i vektora povezanih s generiranjem slika pozitivnog i negativnog faznog kontrasta prikazan je na slici 1. Također su prikazani primjeri uzoraka snimljenih ovim tehnikama. U pozitivnoj optičkoj konfiguraciji faznog kontrasta (gornji red slike na slici 1), surround (S)-valna fronta prolazi kroz faznu ploču, što rezultira neto faznim pomakom od 180 stupnjeva u fazi napredovanja, za 1/4 valne duljine ( 1 poluvalna duljina). Napredne surround valne fronte sada mogu sudjelovati u destruktivnoj interferenciji s difrakcijskim (D) valovima na srednjoj ravnini slike. U većini slučajeva samo pomicanje relativne faze okolne valne fronte nije dovoljno da rezultira stvaranjem slika visokog kontrasta u Nikonovim mikroskopima. To je zato što je amplituda okružujućih valova znatno veća od amplitude difrakcijskih valova i potiskuje rezultirajuću sliku koju stvara interferencija iz dijela ukupnog broja valova. Kako bi se okolna valna fronta smanjila na vrijednost bližu amplitudi difraktiranih valova (i izvršila interferencija u ravnini slike), neprozirnost u faznom prstenu objektiva postiže se primjenom poluprozirnog metala (neutralno povećanje gustoće ) premaz Pod. Okolni svjetlosni valovi, koji prema dizajnu prolaze gotovo u potpunosti kroz fazni prsten, pod fazno kontrastnom mikroskopijom, značajno su smanjeni u amplitudi neprozirnošću fazne ploče na vrijednost u rasponu od 10 do 30 posto izvornog intenziteta.
Budući da je rezultirajući čestični val proizveden interferencijom* okolnih i difraktiranih valnih fronti, amplituda čestičnog (P) vala proizvedenog interferencijom između valnih fronti koje stižu u ravninu slike sada je mnogo manja od one okolne kada je u Seksualnom primijenjen premaz gustoće. Konačni učinak je pretvaranje relativne fazne razlike uvedene prolaskom svjetlosti koja izlazi iz ravnine slike kroz uzorak u razliku u amplitudi (intenzitetu). Budući da će ljudsko oko protumačiti razliku u intenzitetu kao kontrast, uzorak je sada vidljiv u okularu mikroskopa, a također se može uhvatiti na membrani s konvencionalnim sustavima kamera ili digitalno, pomoću CCD ili CMOS uređaja. Svi sustavi pozitivnog faznog kontrasta selektivno pomiču fazu linearne surround (S)-valne fronte u odnosu na sferičnu difraktiranu (D) valnu frontu. Uzorci s višim indeksom loma od okolnog medija izgledaju tamnije na neutralnoj sivoj pozadini, dok oni s nižim indeksom loma od medija za plivanje izgledaju svjetlije od sive pozadine.
Kako bi se modificiralo prostorno razdvajanje difraktiranih valnih fronti koje okružuju fazu i amplitudu u optičkom sustavu faznog kontrasta, uveden je niz konfiguracija fazne ploče. Budući da se fazna ploča nalazi na ili vrlo blizu stražnje žarišne ravnine (difrakcijske ravnine) objektiva, sva svjetlost koja prolazi kroz mikroskop mora proći kroz ovu komponentu. Dio fazne ploče u prstenastom fokusu kondenzatora naziva se konjugirano područje, dok se preostalo područje naziva komplementarno područje. Konjugirano područje sadrži materijal odgovoran za promjenu faze okolne (nedifraktirane) svjetlosti za plus ili minus 90 stupnjeva u odnosu na difraktiranu valnu frontu. Općenito, područje fazno konjugiranog prstena je šire (oko 25 posto) od područja definiranog slikom kondenzirajućeg prstena kako bi se smanjila količina okolne svjetlosti koja se širi do komplementarnog područja.
Većina faznih ploča dostupnih od modernih proizvođača mikroskopa su one pripremljene vakuumskim taloženjem tankih dielektričnih i metalnih filmova na staklenu ploču ili postavljene izravno na površinu leće objektiva mikroskopa. Uloga dielektričnog filma je faziranje svjetlosti, dok metalni film prigušuje intenzitet nedifraktirane svjetlosti. Neki proizvođači koriste višestruke antirefleksne premaze u kombinaciji s filmom kako bi smanjili količinu odsjaja i refleksije zalutale svjetlosti natrag u optički sustav. Ako fazna ploča nije oblikovana na površini leće, obično je zacementirana između uzastopnih leća koje se nalaze u žarišnoj ravnini blizu stražnje strane objektiva. Debljina i indeks loma dielektričnih, metalnih i antirefleksijskih premaza, kao i onih optičkog cementa, pažljivo su odabrani kako bi proizveli željeni fazni pomak između komplementarnih i konjugiranih područja fazne ploče. U optičkom smislu, fazna ploča koja mijenja fazu u odnosu na okolno svjetlo da difraktira svjetlost za 90 stupnjeva (bilo pozitivno ili negativno) naziva se četvrtvalna ploča zbog učinka razlike optičke putanje na nju.
Pregled obrnute pozitivne faze prikazan je na slici 1. Kontrastna ploča pozitivne faze (lijeva strana slike 1) pokreće okružujući val za 1/4 valne duljine, zbog prstena erozije u staklenoj ploči, koji može biti smanjen gornjim prolazom u ploči s visokim indeksom Fizička putanja vala. Zbog interakcije s uzorkom, kada su difraktirane zrake uzorka (D) usporene, optička razlika putanje između okružujućih i difraktiranih valova koji izlaze iz fazne ploče je pola valne duljine za 1/4 valne duljine. Konačni rezultat je razlika u optičkoj putanji od 180- stupnjeva između okolnih i difrakcijskih valova, što rezultira destruktivnom interferencijom za uzorke s visokim indeksom loma između ravnina slike. Krivulja amplitude za pozitivnu fazu suprotnog destruktivnog interferencijskog vala prikazana je na gornjem grafikonu na slici 1. Rezultirajući čestični (P) val ima manju amplitudu od okružujućeg (S) vala, zbog čega objekt izgleda u usporedbi s relativno tamnija pozadina. Dolje, slika zelene alge Zygnema prikazana desno (označena kao DL). Vektor predstavljen napredovanjem 1/4 valne duljine, koji je prikazan kao 90-stupnjeva rotirajući okružujući val u smjeru suprotnom od kazaljke na satu u pozitivnom faznom kontrastu, pojavljuje se između slike i slike na slici 1.
Alternativno, optika mikroskopa također se može proizvesti za proizvodnju suprotne negativne faze, kao što je prikazano u donjem dijelu slike 1, u kojem slučaju okružujući (S)-valovi kasne (umjesto kao napredni) za četvrtinu valne duljine u odnosu na jedan difraktirani (D) val. Kao rezultat toga, uzorci s visokim indeksom loma izgledaju svjetlije na tamnijoj sivoj pozadini (pogledajte donju sliku označenu BM na slici 1). U suprotnoj negativnoj fazi, fazna ploča objektiva sadrži uzdignuti prsten koji usporava fazu (umjesto da fazu napreduje kao pozitivnu suprotnu fazu), prolazeći četvrtinu valne duljine u odnosu na fazu difraktiranog vala kao surround val nultog reda. Budući da su difraktirani valovi odgođeni za četvrtinu valne duljine dok prolaze kroz uzorak, optička razlika putanje između okolnih i difrakcijskih valova je eliminirana i uzorak s visokim indeksom refrakcije konstruktivno interferira u ravnini slike. Imajte na umu da je rezultirajući val čestica (P) veće amplitude od surround (S) vala u negativnom faznom kontrastu. Također je prikazan negativni fazni obrat, gdje vektor cirkumnavigacije prolazi kroz rotaciju vektorskog dijagrama za 90 stupnjeva u smjeru kazaljke na satu.
