Postoje dvije vrste fluorescentnih mikroskopa s obzirom na njihov optički put
1. Transmisijski fluorescentni mikroskop: Ekscitacijski izvor svjetlosti prolazi kroz materijal uzorka kroz kondenzatorsku leću kako bi se pobudila fluorescencija. Obično se koristi kolektor tamnog polja, a obični kolektor također se može koristiti za podešavanje zrcala tako da se pobudna svjetlost preusmjeri i zaobiđe na uzorak. Ovo je stariji fluorescentni mikroskop. Prednost je što je fluorescencija jaka pri malom povećanju, ali nedostatak je što fluorescencija opada s povećanjem povećanja. Stoga je bolje promatrati materijale većih uzoraka.
2. Epi-fluorescentni mikroskop je nova vrsta fluorescentnog mikroskopa razvijena u moderno doba. Razlika je u tome što pobudna svjetlost pada s leće objektiva na površinu uzorka, odnosno ista leća objektiva koristi se kao kondenzor osvjetljenja i leća objektiva za prikupljanje fluorescencije. Dihroični razdjelnik snopa treba dodati na put svjetlosti, koji je 45 stupnjeva udaljen od svjetlosnog urana. Pobuđeno svjetlo se reflektira u leću objektiva i skuplja na uzorku. Fluorescencija koju stvara uzorak i pobudna svjetlost koju reflektira površina leće objektiva i površina pokrovnog stakla ulaze u leću objektiva u isto vrijeme i vraćaju se u dvobojni razdjelnik snopa kako bi se pobudna svjetlost odvojila od fluorescencije , preostalo pobudno svjetlo apsorbiraju blokirajući filtri. Kao što je prelazak na kombinaciju različitih ekscitacijskih filtara/dvobojnog razdjelnika snopa/blokirajućeg filtra, može zadovoljiti potrebe različitih proizvoda fluorescentne reakcije. Prednost ovakvog fluorescentnog mikroskopa je što je osvjetljenje vidnog polja ravnomjerno, slika je jasna, a što je veće povećanje, to je fluorescencija jača.
